Design, Synthesis, and Biological Activity of new Roflumilast Analogues as Selective PDE-4B Inhibitors/
Ahmed Mohammed Ibrahim Ali Moussa,
Design, Synthesis, and Biological Activity of new Roflumilast Analogues as Selective PDE-4B Inhibitors/ تصميم وتشييد والفاعلية البيولوجية لنظائر الروفلوميلاست الجديدة كمثبطات انتقائية لانزيم الفوسفو داي استريز-4-ب/ Ahmed Mohammed Ibrahim Ali Moussa ; Supervisiors: Dr. Heba Abd El-Rasheed Abd El-Khalek Allam, Dr. Ahmed Ali Esmail Al-Karmalawy. - 151 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (M.Sc.) -Cairo University, 2023.
Bibliography: pages 123-154.
Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a progressive disease, meaning that over time it typically worsens, and it is characterized by long-term breathing problems and poor airflow, shortness of breath and a sputum-producing cough. Many inflammatory cells and mediators participate in COPD symptoms such as bronchitis and emphysema, so antagonizing their receptors become a challenge for a medicinal chemist to find new chemical entities (NCEs) that play this role. Many treatments had been developed for COPD as inhaled corticosteroids, inhibitors of inducible nitric oxide synthase(i-NOS), leukotriene inhibitors, adhesion-molecule blockers, chemokine inhibitors, TNF-α inhibitors, NFκB inhibitors, p38 MAPK inhibitors, Phosphoinositide-3-kinase (PI3K) inhibitors and Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) activators.
The wide distribution of phosphodiestrase-4 (PDE-4) enzymes in inflammatory cells and in the lung in which PDE-4 inactivates 3',5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) which is highly expressed in inflammatory cells, and so, inhibitors of PDE-4 enzyme cause a decrease in inflammatory response which is increased in COPD. Therefore, selective phosphodiestrase-4 (PDE-4) inhibitor treatment has been a very effective treatment strategy. PDE-4 enzymes are classified into 4 subtypes (4 A-D) which show a similarity of 78% in the active catalytic site. It has been revealed that selective inhibition of PDE-4B showed a potent anti-inflammatory effect not associated with emesis side effect accompanied with the inhibition of PDE-4D enzyme.
Roflumilast was marketed in the USA in 2012 for the treatment of COPD as a PDE-4 inhibitor. Though, its side effects, such as gastrointestinal upsets, headache, and weight loss limited its therapeutic potential. Roflumilast is rapidly metabolized to its active metabolite, roflumilast N-oxide, which has twofold to threefold specificity and potency less than roflumilast. The main cytochrome P450 enzymes that are responsible for the conversion of roflumilast to its N-oxide metabolite are CYP3A4 and 1A2. As the activity ofthese two enzymes can be affected by interindividual variables, so it is can be predicted that these variables can affect roflumilast pharmacokinetic.
A phosphodiesterase (PDE) is an enzyme that breaks a phosphodiester bond in cAMP and cGMP. Phosphodiesterase-4 (PDE-4) is the primary enzyme that regulates the turnover of cAMP.Phosphodiestrase-4 (PDE-4) enzyme is important target in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD).Notably, PDE-4D is expressed in the chemo-sensitive trigger zone in the brainstem, and it appears to be particularly significant in nausea and vomiting. This isoenzyme appears to be less important for anti-inflammatory effects. Therefore, a selective (PDE-4) inhibitor has been identified as a very effective treatment strategyagainst inflammation. It has been revealed that selective inhibition of PDE-4B showed a potent anti-inflammatory effect without emesis as a side effect accompanied by the inhibition of the PDE-4D enzyme.
In the present work, we designed and synthesized new roflumilast analogues with preferential-selective PDE-4B inhibition activity with good potency. To accomplish this target; synthesis of novel series (IVa-u), (Va-i), (VIa-f), (VII), (VIIIa-i), (IX), (X) was done, aiming at obtaining new PDE-4B inhibitors hits based on the proposed pharmacophore, 1-(cyclopropylmethoxy)-2-(difluoromethoxy) benzene moiety. Forty-nine new compounds were prepared via different synthetic routes. The purity of the synthesized compounds was monitored by TLC, and detected by UV chamber. The structures of the new compounds were elucidated via microanalysis, 1H NMR, 13C NMR, and IR spectroscopy.
Enzyme assay was used to measure the IC50 values for the PDE-4B inhibition of all the synthesized compounds along with roflumilast as a reference drug. The biology results demonstrated that most of the examined candidates exhibited considerable inhibitory activity against PDE-4B. The six compounds (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi) exhibited the highest potency against PDE-4B enzyme (IC50 = 7.15, 5.50, 7.19, 7.25, 7.42, 8.29 nM, respectively) with no significant inhibition difference from roflumilast (no statistical difference at p< 0.05). Compound IVl was found to be the most potent compound against PDE-4B enzyme in all series with 3-OH and 4-OCH3 substituents (IC50 = 5.50 nM) showing no significant difference with that of roflumilast (IC50 = 2.36 nM).The most potent derivatives were further tested for PDE-4D inhibition activity to investigate their PDE-4B/PDE-4D selectivity ratio.The most selective compounds are IVg, VIIIi and VIIIh.
Compound IVg showed the highest selectivity towards PDE-4B isozyme more than the reference compound roflumilast, (PDE-4D/4B IC50 Ratio for compound IVg = 3.22, and for roflumilast = 3.02).The most potent compounds (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi) were subjected to further investigation, and their effects on cAMP level and percentage of inhibition of Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) were studied and compared with reference compound roflumilast. Compound IVm, was superior as it showed the highest increase in the level of intracellular cAMP (6.55±0.37 pmole/mL) but still lower than the reference compound (8.40±0.79 pmole/mL). Compound IVs showed the highest % of TNF-α inhibition (77.22%) but still lower than the reference compoundroflumilast (81.58%).
This work was supported by the docking studies at the active site of the PDE-4B enzyme for the most potent compounds (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi) showing good potency against PDE-4B. Simulation docking investigations were carried out to gain insight into the potential binding mechanism of the newly synthesized compounds in the PDE-4B binding site. The docking results were in good accordance with the biological screening results. All of the most potent compounds against PDE-4B showed higher docking scores (S) than roflumilast.
The thesis contains:
1) Introduction:
This part includes a brief literature review on the different classes of COPD drugs according to their mechanism of action, PDE-4 inhibitors, and selective PDE-4B inhibitors.
2) Aim of the work (Research Objectives):
This part presents the aim and the rational upon which the designed compounds were synthesized.
3) Theoretical discussion:
It deals with the theoretical discussion of the experimental synthetic methods adopted for the synthesis of the designed compounds as well as the different analytical methods applied for the characterization and confirmation of the new compounds. Three synthetic schemes were provided to illustrate the adopted synthetic pathways.This part also includes the screening of the newly synthesized compounds for their PDE-4B inhibitory activity using roflumilast as a reference compound. The most potent derivatives were further tested for PDE-4D inhibition activity to investigate their PDE-4B/PDE-4D selectivity ratio.
The level of intracellular cAMP and the percentage of inhibition of the inflammatory mediator TNF-α were also measured for additional biological evaluation. Also, it involves the results of molecular docking of compounds showing remarkable PDE-4B inhibitory activity (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi) to study their binding mode to the active site of the enzyme in comparison to roflumilast as reference drug.
4) Experimental work:
In this part, the practical procedures used for the synthesis of the known starting, new intermediate, and new final compounds were described, in addition, their physical, spectral, and microanalytical data were cited. This part also includes the methods used for biological measurements and molecular docking.
The following compounds were prepared:
I- Reported compounds: (1 compound)
• Methyl 3-(cyclopropyl methoxy)-4-(difluoromethoxy) benzoate II.
II- New compounds:
IIa- New intermediate:(1 compound)
• 3-(Cyclopropyl methoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide III.
IIb- New target compounds:(48 compounds)
1. N'-Benzylidene-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IVa.
2. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-fluorobenzylidene)benzohydrazide IVb.
3. N'-(4-Chlorobenzylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IVc.
4. N'-(3-Bromobenzylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IVd.
5. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-methoxybenzylidene) benzohydrazide IVe.
6. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-methylbenzylidene)benzohydrazide IVf.
7. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-nitrobenzylidene)benzohydrazide IVg.
8. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3-methoxybenzylidene) benzohydrazide IVh.
9. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3,4-dimethoxybenzylidene) benzohydrazide IVi.
10. 3-(Cyclopropylmethoxy)-N'-(2,6-dichlorobenzylidene)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide IVj.
11. 3-(Cyclopropylmethoxy)-N'-(3,4-dichlorobenzylidene)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide IVk.
12. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene) benzohydrazide IVl.
13. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene) benzohydrazide IVm.
14. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(furan-2-ylmethylene)benzohydrazide IVn.
15. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3-phenylallylidene)benzohydrazide IVo.
16. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3-nitrobenzylidene)benzohydrazide IVp.
17. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(2-(trifluoromethyl)benzylidene) benzohydrazide IVq.
18. N'-(2-Chlorobenzylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IVr.
19. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(2-nitrobenzylidene)benzohydrazide IVs.
20. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-(dimethylamino)benzylidene) benzohydrazide IVt.
21. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(2-hydroxybenzylidene) benzohydrazide IVu.
22. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-phenylethylidene)benzohydrazide Va.
23. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(4-fluorophenyl)ethylidene) benzohydrazide Vb.
24. N'-(1-(4-Chlorophenyl)ethylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide Vc.
25. N'-(1-(4-Bromophenyl)ethylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide Vd.
26. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(4-methoxyphenyl)ethylidene) benzohydrazide Ve.
27. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(p-tolyl)ethylidene)benzohydrazide Vf.
28. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(4-nitrophenyl)ethylidene) benzohydrazide Vg.
29. N'-(1-(3-Aminophenyl)ethylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide Vh.
30. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(3,4-dimethoxyphenyl) ethylidene)benzohydrazide Vi.
31. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(2-oxoindolin-3-ylidene) benzohydrazide VIa.
32. N'-(5-Bromo-2-oxoindolin-3-ylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide VIb.
33. N'-(5-Chloro-2-oxoindolin-3-ylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide VIc.
34. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(5-nitro-2-oxoindolin-3-ylidene) benzohydrazide VId.
35. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(5-methoxy-2-oxoindolin-3-ylidene)benzohydrazide VIe.
36. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene) benzohydrazide VIf.
37. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N-(4,5,6,7-tetrachloro-1,3-dioxo isoindolin-2-yl)benzamide VII.
38. N'-Benzoyl-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazideVIIIa.
39. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-fluorobenzoyl)benzohydrazide VIIIb.
40. N'-(4-Chlorobenzoyl)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide VIIIc.
41. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-iodobenzoyl)benzohydrazide VIIId.
42. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-methylbenzoyl)benzohydrazide VIIIe.
43. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-nitrobenzoyl)benzohydrazide VIIIf.
44. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-methoxybenzoyl)benzohydrazide VIIIg.
45. N'-(3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzoyl)-3,4,5-trimethoxy benzohydrazide VIIIh.
46. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3,5-dinitrobenzoyl)benzohydrazide VIIIi.
47. N'-Cyclohexylidene-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IX.
48. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N-(2,5-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl) benzamide X.
• The final target synthesized derivatives (IVa-u), (VIa-i), (VIa-f), (VII), (VIIIa-i), (IX), (X) are listed in Scheme (1), Scheme (2), Scheme (3).
5) References:
This part comprises two hundred ninety-six references stated in the thesis.
6) Arabic summary.
مرض الانسداد الرئوي المزمنهو مرض تدريجي، مما يعني أنه بمرور الوقت يتفاقم عادةً، ويتميز بمشاكل في التنفس على المدى الطويل وضعف تدفق الهواء وضيق التنفس والسعال المنتج للبلغم.تشارك العديد من الخلايا ووسطاء الالتهاب في أعراض مرض الانسداد الرئوي المزمن مثل التهاب الشعب الهوائية وانتفاخ الرئة ، لذا فإن استعداء مستقبلاتها يصبح تحديًا للكيميائي الطبي لإيجاد كيانات كيميائية جديدةتلعب هذا الدور. تم تطوير العديد من العلاجات لمرض الانسداد الرئوي المزمن مثل الكورتيكوستيرويدات المستنشقة، ومثبطات سينثاز أكسيد النيتريك المحفز، ومثبطات الليكوترين، وحاصرات جزيء الالتصاق، ومثبطات كيموكين، مثبطاتتي ان اف الفا، مثبطاتان اف كابا، مثبطاتبروتين كيناز المنشط بالميتوجين، مثبطاتفوسفوينوزيتيد-3-كينازوالمستقبلات المنشطة لتكاثرالبيروكسيسوم.
الانتشار الواسع لإنزيمات الفوسفوديستراز-4في الخلايا الالتهابية والرئة حيث يعملفوسفودايستريز-4 على تعطيل أحادي فوسفات الأدينوزين الحلقي والذي يتم التعبير عنه بشكل كبير في الخلايا الالتهابية، وبالتالي، مثبطات الفوسفودايستريز-4تسبب انخفاضًا في الاستجابة الالتهابية التي تزداد في مرض الانسداد الرئوي المزمن، لذلك كان العلاج بمثبطات الفوسفوديستريز-4 استراتيجية علاج فعالة جدا.يتم تصنيف إنزيماتفوسفودايستريز-4 إلى 4 أنواع فرعية (4 أ-4 د) والتي تظهر تشابهًا بنسبة 78٪ في الموقع التحفيزي النشط.لقد تم الكشف عن أن التثبيط الانتقائي لـإنزيماتفوسفودايستريز-4-بأظهر تأثيرًا قويًا مضادًا للالتهابات غيرمرتبط بالتقيؤ كأثر جانبي مصاحبلتثبيطإنزيماتفوسفودايستريز-4- د.
تم تسويق عقارالروفلوميلاستفي الولايات المتحدة الأمريكية في عام 2012 لعلاج مرض الانسداد الرئوي المزمن كمثبطللفوسفودايستريز-4 على الرغم من أن آثاره الجانبية ، مثل اضطرابات الجهاز الهضمي والصداع وفقدان الوزن ، حدت من إمكاناته العلاجية.يتم استقلابالروفلوميلاستبسرعة إلى مستقلبه النشط روفلوميلاست اوكسيد النيتروجين، والذي يتميز بخصوصية وفعالية أقل بمرتين إلى ثلاثة أضعاف من فعاليةالروفلوميلاست. إن إنزيمات السيتوكرومبي450الرئيسية المسؤولة عن تحويلالروفلوميلاست إلى مستقلب أكسيد النيتروجين هي السيتوكرومبي 3A4و 1A2.
نظرًا لأن نشاط هذين الإنزيمين يمكن أن يتأثر بالمتغيرات بين الأفراد ، لذلك يمكن التنبؤ بأن هذه المتغيرات يمكن أن تؤثرعلى الحركيه الدوائية للروفلوميلاست.
في العمل الحالي ، تم تصميم وتشييد نظائر Roflumilast جديدة مع نشاط تثبيط تفضيلي انتقائي لانزيم PDE-4B مع فعالية جيدة ولتحقيق هذا الهدف ؛ تم تشييد سلسلة جديدة (IVa-u) ، (Va-i)، (VIa-f)، (VII) ، (VIIIa-i)، (IX)، (X) بهدف الحصول على مثبطات PDE-4B جديدة.تم قياس قيم IC50 لتثبيط انزيم PDE-4B للمركبات المصنعهباستخدامRoflumilast كدواء مرجعي.أظهرت نتائج القياسات البيولوجيه أن معظم المركبات أظهرت نشاطًا مثبطًا كبيرًا ضد PDE-4B.
ستة منهم (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi)أظهروا أنشطة مثبطة ممتازة تفوق المشتقات الأخرى .تم اختبار أكثر المشتقات فعالية لمزيد من نشاط تثبيط PDE-4D للتحقيق في نسبة انتقائية
.(PDE-4B / PDE-4D) تم أيضًا قياس مستوى cAMP داخل الخلايا والنسبة المئوية لتثبيط الوسيط الالتهابي TNF-α من أجل التقييم البيولوجي الإضافي.
وتشمل الرسالة الأجزاء التالية:
1. المقدمة:
و تتضمن هذة المقدمة سردا مختصرا عن نظائر الروفلوميلاست الجديدة كمثبطات انتقائية لانزيم الفوسفو داي استريز- 4-ب والتي لها فاعلية فيانخفاض الاستجابة الالتهابية التي تزداد في مرض الانسداد الرئوي المزمن.
2. الهدف من البحث:
يوضح هذا القسم الأساس العلمي الذي تم على أساسه تصميم المركبات المحضرة.
3. المناقشة النظرية للجزء العملي:
يتضمن هذا الجزء مناقشة الطرق المعملية المذكورة في الدوريات العلمية و المستخدمة في تشييد المركبات الوسطية و النهائية واختيار المناسب منها لتطبيقه في هذا البحث و كذلك مناقشة طرق التأكد من التركيب البنائي للمركبات المشيدة.
كمايتضمن هذا الجزء نتائج دراسة و تقييم المركبات المستهدفة لنشاط تثبيط انزيماتPDE-4B and PDE-4D باستخدام Roflumilast كمركب مرجعي. كذلك تم إخضاع المركبات التي تظهر نشاطاً مثبطاً لانزيمPDE-4B للنشاط المثبطضد PDE-4Dباستخدام Roflumilast كمركب مرجعي.تم اختبار أكثر المشتقات فعالية لمزيد من نشاط تثبيط PDE-4D للتحقيق في نسبة انتقائيةPDE-4B / PDE-4D.
تم أيضًا قياس مستوى cAMP داخل الخلايا والنسبة المئوية لتثبيط الوسيط الالتهابي TNF-α من أجل التقييم البيولوجي الإضافي.
وأيضاًيشمل هذا الجزء على دراسة الارساء الجزيئي للمركبات الأعلى فاعلية لتثبيط انزيم PDE-4Bوعددها 6 مركبات على الموقع النشط من الانزيم باستخدام برنامج (MOE) وذلك لايجاد علاقة بين النشاط المثبط للانزيم وقدرة المركبات على الارتباط بالأحماض الأمينية التي تكون روابط مع الدواء المرجعي Roflumilast لايجاد علاقة بين النشاط البيولوجي مع القدرة على تثبيط انزيم PDE-4B كآلية عمل لهذه المركبات.
4. الجزء العملي:
يتناول هذا الجزء شرح تفصيلي للطرق العلمية المستخدمة لتحضير المركبات الوسيطة والنهائية المعروفة وكذلك المركبات النهائية الجديدة مع سرد الخصائص الفيزيائية للمركبات ونتائج التحاليل الطيفية (طيف الأشعة تحتالحمراء, طيف الكتلة, الرنين النووي المغناطيسي لنواتي الهيدروجين والكربون) و التحليل الدقيق للعناصر وكذلك الطرق المستخدمة للقياسات البيولوجية والإرساء الجزيئي.
5. المراجع العلمية:
تحتوي الرسالة على عدد 296مرجعا محليا وعالميا تغطي الفترة من عام 1864 الى عام 2023 .
Text in English and abstract in Arabic & English.
Pharmaceutical Chemistry
Phosphodiesterase 4B inhibitor Chronic obstructive pulmonary disease Roflumilast
615.19
Design, Synthesis, and Biological Activity of new Roflumilast Analogues as Selective PDE-4B Inhibitors/ تصميم وتشييد والفاعلية البيولوجية لنظائر الروفلوميلاست الجديدة كمثبطات انتقائية لانزيم الفوسفو داي استريز-4-ب/ Ahmed Mohammed Ibrahim Ali Moussa ; Supervisiors: Dr. Heba Abd El-Rasheed Abd El-Khalek Allam, Dr. Ahmed Ali Esmail Al-Karmalawy. - 151 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (M.Sc.) -Cairo University, 2023.
Bibliography: pages 123-154.
Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a progressive disease, meaning that over time it typically worsens, and it is characterized by long-term breathing problems and poor airflow, shortness of breath and a sputum-producing cough. Many inflammatory cells and mediators participate in COPD symptoms such as bronchitis and emphysema, so antagonizing their receptors become a challenge for a medicinal chemist to find new chemical entities (NCEs) that play this role. Many treatments had been developed for COPD as inhaled corticosteroids, inhibitors of inducible nitric oxide synthase(i-NOS), leukotriene inhibitors, adhesion-molecule blockers, chemokine inhibitors, TNF-α inhibitors, NFκB inhibitors, p38 MAPK inhibitors, Phosphoinositide-3-kinase (PI3K) inhibitors and Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) activators.
The wide distribution of phosphodiestrase-4 (PDE-4) enzymes in inflammatory cells and in the lung in which PDE-4 inactivates 3',5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) which is highly expressed in inflammatory cells, and so, inhibitors of PDE-4 enzyme cause a decrease in inflammatory response which is increased in COPD. Therefore, selective phosphodiestrase-4 (PDE-4) inhibitor treatment has been a very effective treatment strategy. PDE-4 enzymes are classified into 4 subtypes (4 A-D) which show a similarity of 78% in the active catalytic site. It has been revealed that selective inhibition of PDE-4B showed a potent anti-inflammatory effect not associated with emesis side effect accompanied with the inhibition of PDE-4D enzyme.
Roflumilast was marketed in the USA in 2012 for the treatment of COPD as a PDE-4 inhibitor. Though, its side effects, such as gastrointestinal upsets, headache, and weight loss limited its therapeutic potential. Roflumilast is rapidly metabolized to its active metabolite, roflumilast N-oxide, which has twofold to threefold specificity and potency less than roflumilast. The main cytochrome P450 enzymes that are responsible for the conversion of roflumilast to its N-oxide metabolite are CYP3A4 and 1A2. As the activity ofthese two enzymes can be affected by interindividual variables, so it is can be predicted that these variables can affect roflumilast pharmacokinetic.
A phosphodiesterase (PDE) is an enzyme that breaks a phosphodiester bond in cAMP and cGMP. Phosphodiesterase-4 (PDE-4) is the primary enzyme that regulates the turnover of cAMP.Phosphodiestrase-4 (PDE-4) enzyme is important target in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD).Notably, PDE-4D is expressed in the chemo-sensitive trigger zone in the brainstem, and it appears to be particularly significant in nausea and vomiting. This isoenzyme appears to be less important for anti-inflammatory effects. Therefore, a selective (PDE-4) inhibitor has been identified as a very effective treatment strategyagainst inflammation. It has been revealed that selective inhibition of PDE-4B showed a potent anti-inflammatory effect without emesis as a side effect accompanied by the inhibition of the PDE-4D enzyme.
In the present work, we designed and synthesized new roflumilast analogues with preferential-selective PDE-4B inhibition activity with good potency. To accomplish this target; synthesis of novel series (IVa-u), (Va-i), (VIa-f), (VII), (VIIIa-i), (IX), (X) was done, aiming at obtaining new PDE-4B inhibitors hits based on the proposed pharmacophore, 1-(cyclopropylmethoxy)-2-(difluoromethoxy) benzene moiety. Forty-nine new compounds were prepared via different synthetic routes. The purity of the synthesized compounds was monitored by TLC, and detected by UV chamber. The structures of the new compounds were elucidated via microanalysis, 1H NMR, 13C NMR, and IR spectroscopy.
Enzyme assay was used to measure the IC50 values for the PDE-4B inhibition of all the synthesized compounds along with roflumilast as a reference drug. The biology results demonstrated that most of the examined candidates exhibited considerable inhibitory activity against PDE-4B. The six compounds (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi) exhibited the highest potency against PDE-4B enzyme (IC50 = 7.15, 5.50, 7.19, 7.25, 7.42, 8.29 nM, respectively) with no significant inhibition difference from roflumilast (no statistical difference at p< 0.05). Compound IVl was found to be the most potent compound against PDE-4B enzyme in all series with 3-OH and 4-OCH3 substituents (IC50 = 5.50 nM) showing no significant difference with that of roflumilast (IC50 = 2.36 nM).The most potent derivatives were further tested for PDE-4D inhibition activity to investigate their PDE-4B/PDE-4D selectivity ratio.The most selective compounds are IVg, VIIIi and VIIIh.
Compound IVg showed the highest selectivity towards PDE-4B isozyme more than the reference compound roflumilast, (PDE-4D/4B IC50 Ratio for compound IVg = 3.22, and for roflumilast = 3.02).The most potent compounds (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi) were subjected to further investigation, and their effects on cAMP level and percentage of inhibition of Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) were studied and compared with reference compound roflumilast. Compound IVm, was superior as it showed the highest increase in the level of intracellular cAMP (6.55±0.37 pmole/mL) but still lower than the reference compound (8.40±0.79 pmole/mL). Compound IVs showed the highest % of TNF-α inhibition (77.22%) but still lower than the reference compoundroflumilast (81.58%).
This work was supported by the docking studies at the active site of the PDE-4B enzyme for the most potent compounds (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi) showing good potency against PDE-4B. Simulation docking investigations were carried out to gain insight into the potential binding mechanism of the newly synthesized compounds in the PDE-4B binding site. The docking results were in good accordance with the biological screening results. All of the most potent compounds against PDE-4B showed higher docking scores (S) than roflumilast.
The thesis contains:
1) Introduction:
This part includes a brief literature review on the different classes of COPD drugs according to their mechanism of action, PDE-4 inhibitors, and selective PDE-4B inhibitors.
2) Aim of the work (Research Objectives):
This part presents the aim and the rational upon which the designed compounds were synthesized.
3) Theoretical discussion:
It deals with the theoretical discussion of the experimental synthetic methods adopted for the synthesis of the designed compounds as well as the different analytical methods applied for the characterization and confirmation of the new compounds. Three synthetic schemes were provided to illustrate the adopted synthetic pathways.This part also includes the screening of the newly synthesized compounds for their PDE-4B inhibitory activity using roflumilast as a reference compound. The most potent derivatives were further tested for PDE-4D inhibition activity to investigate their PDE-4B/PDE-4D selectivity ratio.
The level of intracellular cAMP and the percentage of inhibition of the inflammatory mediator TNF-α were also measured for additional biological evaluation. Also, it involves the results of molecular docking of compounds showing remarkable PDE-4B inhibitory activity (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi) to study their binding mode to the active site of the enzyme in comparison to roflumilast as reference drug.
4) Experimental work:
In this part, the practical procedures used for the synthesis of the known starting, new intermediate, and new final compounds were described, in addition, their physical, spectral, and microanalytical data were cited. This part also includes the methods used for biological measurements and molecular docking.
The following compounds were prepared:
I- Reported compounds: (1 compound)
• Methyl 3-(cyclopropyl methoxy)-4-(difluoromethoxy) benzoate II.
II- New compounds:
IIa- New intermediate:(1 compound)
• 3-(Cyclopropyl methoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide III.
IIb- New target compounds:(48 compounds)
1. N'-Benzylidene-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IVa.
2. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-fluorobenzylidene)benzohydrazide IVb.
3. N'-(4-Chlorobenzylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IVc.
4. N'-(3-Bromobenzylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IVd.
5. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-methoxybenzylidene) benzohydrazide IVe.
6. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-methylbenzylidene)benzohydrazide IVf.
7. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-nitrobenzylidene)benzohydrazide IVg.
8. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3-methoxybenzylidene) benzohydrazide IVh.
9. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3,4-dimethoxybenzylidene) benzohydrazide IVi.
10. 3-(Cyclopropylmethoxy)-N'-(2,6-dichlorobenzylidene)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide IVj.
11. 3-(Cyclopropylmethoxy)-N'-(3,4-dichlorobenzylidene)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide IVk.
12. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene) benzohydrazide IVl.
13. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene) benzohydrazide IVm.
14. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(furan-2-ylmethylene)benzohydrazide IVn.
15. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3-phenylallylidene)benzohydrazide IVo.
16. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3-nitrobenzylidene)benzohydrazide IVp.
17. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(2-(trifluoromethyl)benzylidene) benzohydrazide IVq.
18. N'-(2-Chlorobenzylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IVr.
19. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(2-nitrobenzylidene)benzohydrazide IVs.
20. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-(dimethylamino)benzylidene) benzohydrazide IVt.
21. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(2-hydroxybenzylidene) benzohydrazide IVu.
22. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-phenylethylidene)benzohydrazide Va.
23. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(4-fluorophenyl)ethylidene) benzohydrazide Vb.
24. N'-(1-(4-Chlorophenyl)ethylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide Vc.
25. N'-(1-(4-Bromophenyl)ethylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide Vd.
26. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(4-methoxyphenyl)ethylidene) benzohydrazide Ve.
27. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(p-tolyl)ethylidene)benzohydrazide Vf.
28. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(4-nitrophenyl)ethylidene) benzohydrazide Vg.
29. N'-(1-(3-Aminophenyl)ethylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide Vh.
30. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-(3,4-dimethoxyphenyl) ethylidene)benzohydrazide Vi.
31. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(2-oxoindolin-3-ylidene) benzohydrazide VIa.
32. N'-(5-Bromo-2-oxoindolin-3-ylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide VIb.
33. N'-(5-Chloro-2-oxoindolin-3-ylidene)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy) benzohydrazide VIc.
34. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(5-nitro-2-oxoindolin-3-ylidene) benzohydrazide VId.
35. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(5-methoxy-2-oxoindolin-3-ylidene)benzohydrazide VIe.
36. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(1-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene) benzohydrazide VIf.
37. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N-(4,5,6,7-tetrachloro-1,3-dioxo isoindolin-2-yl)benzamide VII.
38. N'-Benzoyl-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazideVIIIa.
39. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-fluorobenzoyl)benzohydrazide VIIIb.
40. N'-(4-Chlorobenzoyl)-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide VIIIc.
41. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-iodobenzoyl)benzohydrazide VIIId.
42. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-methylbenzoyl)benzohydrazide VIIIe.
43. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-nitrobenzoyl)benzohydrazide VIIIf.
44. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(4-methoxybenzoyl)benzohydrazide VIIIg.
45. N'-(3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzoyl)-3,4,5-trimethoxy benzohydrazide VIIIh.
46. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N'-(3,5-dinitrobenzoyl)benzohydrazide VIIIi.
47. N'-Cyclohexylidene-3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)benzohydrazide IX.
48. 3-(Cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)-N-(2,5-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl) benzamide X.
• The final target synthesized derivatives (IVa-u), (VIa-i), (VIa-f), (VII), (VIIIa-i), (IX), (X) are listed in Scheme (1), Scheme (2), Scheme (3).
5) References:
This part comprises two hundred ninety-six references stated in the thesis.
6) Arabic summary.
مرض الانسداد الرئوي المزمنهو مرض تدريجي، مما يعني أنه بمرور الوقت يتفاقم عادةً، ويتميز بمشاكل في التنفس على المدى الطويل وضعف تدفق الهواء وضيق التنفس والسعال المنتج للبلغم.تشارك العديد من الخلايا ووسطاء الالتهاب في أعراض مرض الانسداد الرئوي المزمن مثل التهاب الشعب الهوائية وانتفاخ الرئة ، لذا فإن استعداء مستقبلاتها يصبح تحديًا للكيميائي الطبي لإيجاد كيانات كيميائية جديدةتلعب هذا الدور. تم تطوير العديد من العلاجات لمرض الانسداد الرئوي المزمن مثل الكورتيكوستيرويدات المستنشقة، ومثبطات سينثاز أكسيد النيتريك المحفز، ومثبطات الليكوترين، وحاصرات جزيء الالتصاق، ومثبطات كيموكين، مثبطاتتي ان اف الفا، مثبطاتان اف كابا، مثبطاتبروتين كيناز المنشط بالميتوجين، مثبطاتفوسفوينوزيتيد-3-كينازوالمستقبلات المنشطة لتكاثرالبيروكسيسوم.
الانتشار الواسع لإنزيمات الفوسفوديستراز-4في الخلايا الالتهابية والرئة حيث يعملفوسفودايستريز-4 على تعطيل أحادي فوسفات الأدينوزين الحلقي والذي يتم التعبير عنه بشكل كبير في الخلايا الالتهابية، وبالتالي، مثبطات الفوسفودايستريز-4تسبب انخفاضًا في الاستجابة الالتهابية التي تزداد في مرض الانسداد الرئوي المزمن، لذلك كان العلاج بمثبطات الفوسفوديستريز-4 استراتيجية علاج فعالة جدا.يتم تصنيف إنزيماتفوسفودايستريز-4 إلى 4 أنواع فرعية (4 أ-4 د) والتي تظهر تشابهًا بنسبة 78٪ في الموقع التحفيزي النشط.لقد تم الكشف عن أن التثبيط الانتقائي لـإنزيماتفوسفودايستريز-4-بأظهر تأثيرًا قويًا مضادًا للالتهابات غيرمرتبط بالتقيؤ كأثر جانبي مصاحبلتثبيطإنزيماتفوسفودايستريز-4- د.
تم تسويق عقارالروفلوميلاستفي الولايات المتحدة الأمريكية في عام 2012 لعلاج مرض الانسداد الرئوي المزمن كمثبطللفوسفودايستريز-4 على الرغم من أن آثاره الجانبية ، مثل اضطرابات الجهاز الهضمي والصداع وفقدان الوزن ، حدت من إمكاناته العلاجية.يتم استقلابالروفلوميلاستبسرعة إلى مستقلبه النشط روفلوميلاست اوكسيد النيتروجين، والذي يتميز بخصوصية وفعالية أقل بمرتين إلى ثلاثة أضعاف من فعاليةالروفلوميلاست. إن إنزيمات السيتوكرومبي450الرئيسية المسؤولة عن تحويلالروفلوميلاست إلى مستقلب أكسيد النيتروجين هي السيتوكرومبي 3A4و 1A2.
نظرًا لأن نشاط هذين الإنزيمين يمكن أن يتأثر بالمتغيرات بين الأفراد ، لذلك يمكن التنبؤ بأن هذه المتغيرات يمكن أن تؤثرعلى الحركيه الدوائية للروفلوميلاست.
في العمل الحالي ، تم تصميم وتشييد نظائر Roflumilast جديدة مع نشاط تثبيط تفضيلي انتقائي لانزيم PDE-4B مع فعالية جيدة ولتحقيق هذا الهدف ؛ تم تشييد سلسلة جديدة (IVa-u) ، (Va-i)، (VIa-f)، (VII) ، (VIIIa-i)، (IX)، (X) بهدف الحصول على مثبطات PDE-4B جديدة.تم قياس قيم IC50 لتثبيط انزيم PDE-4B للمركبات المصنعهباستخدامRoflumilast كدواء مرجعي.أظهرت نتائج القياسات البيولوجيه أن معظم المركبات أظهرت نشاطًا مثبطًا كبيرًا ضد PDE-4B.
ستة منهم (IVg, IVl, IVm, IVs, VIIIh, VIIIi)أظهروا أنشطة مثبطة ممتازة تفوق المشتقات الأخرى .تم اختبار أكثر المشتقات فعالية لمزيد من نشاط تثبيط PDE-4D للتحقيق في نسبة انتقائية
.(PDE-4B / PDE-4D) تم أيضًا قياس مستوى cAMP داخل الخلايا والنسبة المئوية لتثبيط الوسيط الالتهابي TNF-α من أجل التقييم البيولوجي الإضافي.
وتشمل الرسالة الأجزاء التالية:
1. المقدمة:
و تتضمن هذة المقدمة سردا مختصرا عن نظائر الروفلوميلاست الجديدة كمثبطات انتقائية لانزيم الفوسفو داي استريز- 4-ب والتي لها فاعلية فيانخفاض الاستجابة الالتهابية التي تزداد في مرض الانسداد الرئوي المزمن.
2. الهدف من البحث:
يوضح هذا القسم الأساس العلمي الذي تم على أساسه تصميم المركبات المحضرة.
3. المناقشة النظرية للجزء العملي:
يتضمن هذا الجزء مناقشة الطرق المعملية المذكورة في الدوريات العلمية و المستخدمة في تشييد المركبات الوسطية و النهائية واختيار المناسب منها لتطبيقه في هذا البحث و كذلك مناقشة طرق التأكد من التركيب البنائي للمركبات المشيدة.
كمايتضمن هذا الجزء نتائج دراسة و تقييم المركبات المستهدفة لنشاط تثبيط انزيماتPDE-4B and PDE-4D باستخدام Roflumilast كمركب مرجعي. كذلك تم إخضاع المركبات التي تظهر نشاطاً مثبطاً لانزيمPDE-4B للنشاط المثبطضد PDE-4Dباستخدام Roflumilast كمركب مرجعي.تم اختبار أكثر المشتقات فعالية لمزيد من نشاط تثبيط PDE-4D للتحقيق في نسبة انتقائيةPDE-4B / PDE-4D.
تم أيضًا قياس مستوى cAMP داخل الخلايا والنسبة المئوية لتثبيط الوسيط الالتهابي TNF-α من أجل التقييم البيولوجي الإضافي.
وأيضاًيشمل هذا الجزء على دراسة الارساء الجزيئي للمركبات الأعلى فاعلية لتثبيط انزيم PDE-4Bوعددها 6 مركبات على الموقع النشط من الانزيم باستخدام برنامج (MOE) وذلك لايجاد علاقة بين النشاط المثبط للانزيم وقدرة المركبات على الارتباط بالأحماض الأمينية التي تكون روابط مع الدواء المرجعي Roflumilast لايجاد علاقة بين النشاط البيولوجي مع القدرة على تثبيط انزيم PDE-4B كآلية عمل لهذه المركبات.
4. الجزء العملي:
يتناول هذا الجزء شرح تفصيلي للطرق العلمية المستخدمة لتحضير المركبات الوسيطة والنهائية المعروفة وكذلك المركبات النهائية الجديدة مع سرد الخصائص الفيزيائية للمركبات ونتائج التحاليل الطيفية (طيف الأشعة تحتالحمراء, طيف الكتلة, الرنين النووي المغناطيسي لنواتي الهيدروجين والكربون) و التحليل الدقيق للعناصر وكذلك الطرق المستخدمة للقياسات البيولوجية والإرساء الجزيئي.
5. المراجع العلمية:
تحتوي الرسالة على عدد 296مرجعا محليا وعالميا تغطي الفترة من عام 1864 الى عام 2023 .
Text in English and abstract in Arabic & English.
Pharmaceutical Chemistry
Phosphodiesterase 4B inhibitor Chronic obstructive pulmonary disease Roflumilast
615.19