Biochemical and Molecular Studies on Some Chitinolytic Microbial Isolates in Controlling Meloidogyne sp. in Pepper Plant/
Aya Abdalrahman Mohamed Abdellatif,
Biochemical and Molecular Studies on Some Chitinolytic Microbial Isolates in Controlling Meloidogyne sp. in Pepper Plant/ /دراسات كيموحيوية وجزيئية على بعض العزلات الميكروبية المحللة للكيتين فى مقاومة نوع الميليدوجين فى نبات الفلفل Aya Abdalrahman Mohamed Abdellatif ; Supervisors : Prof. Dr. Tahany Mohamed Ali Abd-Elrahman, Prof. Dr. Mohsen Abou Elela Sayed Hamada, Prof. Dr. Atef Abd El-Aziz Hassan Ragab. - 184 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (Ph.D)-Cairo University, 2024.
Bibliography: pages 129-184.
Pepper is subjected to root-knot nematodes that affect its growth and
production. Field observation revealed that the most common symptoms on
naturally infected pepper were characteristic galls and lesions on root, followed
by wilting and stunting of whole plant. The results of this study could be
summarized as the following:
1. The aforementioned symptoms appeared in naturally infested pepper field
at Wadi El Natrun, Beheira Governorate, Egypt, were suspected of being
caused by Meloidogyne incognita and confirmed to be so by molecular
identification using Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)
marker system at Plant Pathology Institute, Agricultural Research Center,
Egypt.
2. On the other hand, five chitinolytic fungal isolates and five chitinolytic
bacterial isolates were isolated on chitin agar selective medium from
healthy pepper rhizosphere at Qalyubia Governorate in North-Eastern
Egypt using selective chitin agar medium.
3. Safety assessment for bacterial isolates was performed and all tested
isolates showed safe properties for agriculture applications.
4. Molecular characterization of the selected fungal and bacterial strains was
performed by polymerase chain reaction (PCR) amplification. Nucleotide
sequencing was used to detect and characterize the fungal isolates, using
the universal primers (ITS-1 and ITS-4), and bacterial isolates using the
universal primers (27F and 1492R). The characterized fungal isolates
were sequenced and submitted into Genebank under accession numbers
i.e., Trichoderma asperellum AF1 (OM760502), T. harzianum AF2
(OP159450), Aspergillus terreus AF3 (OM760510), Talaromyces
pinophilus AF4 (OM760509), T. simmonsii AF5 (OM918230). While, the
characterized bacterial isolates were sequenced and submitted into
Genebank
under
accession
numbers
i.e.,
Chryseobacterium
124
Summary and Conclusion
daecheongense AB1 (MZ148124), Bacillus toyonensis AB2 (MZ148324),
Pseudomonas lini AB3 (MZ148421), Lactobacillus helveticus AB4
(MZ148422), Klebsiella oxytoca AB5 (MZ148423).
5. All characterized microbial isolates were quantitively assayed for their
chitinase production. The highest chitinase activity (10.81 U/mL) and
specific activity (1.53 U/mg) were recorded for T. asperellum. Alo the
chitinase assay revealed that chitinas activity in microorganisms is strain
dependent.
6. Pure nematode culture raised from single egg mass of Meloidogyne
incognita isolated from the target field of pepper plant was used for
providing eggs and juveniles for in vitro study.
7. Three different concentrations (20, 50, and 100 µm) of both of
homogenized growth culture suspensions as well free cells culture filtrates
of the selected microbial isolates were tested against egg hatching and
juveniles vitality of Meloidogyne incognita. Lab experiments proved the
direct correlation between the efficacy of microbial treatments and their
concentration as well as their chitinase activity. T. asperellum was the
most effective microbial strain in suppression of Meloidogyne incognita
egg hatching and juveniles vitality even when used at low concentration.
8. The microscopic studies showed three patterns of egg disruption have
been observed as following: i) Lysis in egg shell, ii) Sporulated eggs, iii)
Hyphal growth on eggs. On the other hand, chitinolytic activity of
bacterial strains induced lysis in eggshell followed by prehatching and
coagulation of J1S.
9. To correlate between in vitro inhibitory action and in vivo activity of
various microbial treatments, the field experiment was performed in
naturally infested pepper field at Wadi El Natrun, Beheira Governorate,
Egypt.
125
Summary and Conclusion
10. Fresh exoskeletons of shrimp were collected and processed to be applied
as cost effective chitinous soil amendment.
11. Two days after transplantation of pepper seedlings, the cultivated soil was
irritated with liquid suspension of natural chitin powder (10 g/L) to act as
food base for chitinolytic microorganisms.
12. The different tested chitinolytic microbial strains were grown on modified
growth media supplemented with colloidal chitin as for induction of
microbial chitinases and were applied as homogenized growth culture
suspensions at dilution of 1:10 (Microbial culture: Tab water).
13. The results of field experiments revealed that all tested microbial isolates
increased the chitinolytic fungal and bacterial population in rhizosphere
and promoted the growth parameters of pepper plants compared to
untreated control. Trichoderma asperellum showed the maximum shoot
weight (260.00g), shoot length (70.33 cm) while Pseudomonas lini and
Lactobacillus helveticus recorded the maximum root length (32.67 and
32.00 cm, respectively).
14. Also, the tested biocontrol agents showed positive impact on pepper yield
and promoted various parameters of fruit quality. The highest total pepper
yield (235.00 g/ plant) was achieved in plants treated by Trichoderma
asperellum. Regarding the fruit quality parameters, the fruits of plants
treated by T. asperellum showed the best quality in terms of total sugars
content (5.54%) and ascorbic acid content (55.73 mg/100g FW).
15. tested chitinolytic microbial agents were significantly effective in
suppressing the final population densities of Meloidogyne incognita in soil
and root relative to untreated check. However, among microbial
treatments, Trichoderma asperellum followed by Lactobacillus helveticus
recorded the highest reduction in M. incognita final population (86.60 and
86.21, % respectively).
126
Summary and Conclusion
16. All chitinolytic microbial treatments achieved remarkable reduction in
root galling and egg masses development. Furthermore, the number of
eggs/egg mass, an indicator for female fertility, was affected negatively
by most of tested treatments. The minimum numbers of galls were
recorded in roots treated with Trichoderma asperellum, T. simmonsii and
T. harzianum amounted to 93.93, 93.93 and 91.65% reduction relative to
untreated control. Bacillus toyonensis showed the minimum reduction in
gall formation (46.97%).
17. The anatomical study revealed that all treatments did not prevent M.
incognita from penetrating the roots but different time was required to
reach the vascular cylinder to develop giant cells and to complete life
cycle. The transverse sections of roots treated with Trichoderma
asperellum, T. harzianum, Pseudomonas lini and Lactobacillus helveticus
showed the healthiest pattern and less necrotic points compared to
untreated control.
18. In vitro and in vivo studies revealed that Trichoderma asperellum was the
most effective chitinolytic microbial strain against Meloidogyne
incognita.
19. Characterization of Trichoderma asperellum was performed using Gas
chromatography-mass spectrometry (GCMS) analysis of the crude
extracts. GC-Mass analysis resulted in presence of 16 active compounds.
In peak four and six, Malic acid, 3TMS derivative (3.09%) and Tartaric
acid, 4TMS derivative (5.68 %) are important organic acids that showed
antinematode effect while s-Triazine trichloride is the major compound in
peak nine (31.93%) and has potent toxicity against many pathogenic fungi
and have antioxidant activity. يعتبر الفلفل من المحاصيل الهامة للإستهلاك المحلى وذلك لقيمته الغذائية العالية كمصدر هام للمعادن والفيتامينات، وكذلك يعتبر ذات ميزة تنافسية لمصر فى الأسواق العالمية والتصديرية. يعد نبات الفلفل أحد أهم العوائل للنيماتودا الممرضة للنبات لا سيما نيماتودا تعقد الجذور. وأثناء عملية الفحص بمنطقة وادى النطرون بمحافظة البحيرة لوحظ أعراض إصابة نيماتودية متمثلة فى ظهور عقد جذرية (أورام) مختلفة الأحجام فى منطقة الجذور. ومع تقدم الإصابة ظهرت أعراض التقزم والذبول الشديد على المجموع الخضرى التى إنتهت بموت النباتات المصابة فى فترة زمنية قصيرة. تم جمع عينات من جذور النباتات المصابة ومن ثم تم التعريف المعملى للمسبب المرضى بنوع الميليدوجين إنكوجنيتا.
يساهم الإستخدام الجائر للمبيدات الكيميائية فى علاج أمراض التربة الشرسة ومنها نيماتودا تعقد الجذور فى ظاهرة الإحتباس الحرارى والتغيرات المناخية التى يعانى منها كوكب الأرض فى الاونة الأخيرة. هذا وقد إستهدفت الدراسة الحالية عزل وتعريف وتطوير الكائنات الحية الدقيقة المحللة للكيتين كمبيدات حيوية فعالة وامنة على البيئة لمكافحة نيماتودا تعقد الجذور حيث تم تطبيقها معمليا وحقليا للوقوف على دورها الحيوى وتأثيرها التضادى فى مكافحة المسبب المرضى.
ويمكن تلخيص النتائج المتحصل عليها فيما يلى:
1- تم عزل خمس عزلات فطرية محللة للكيتين وخمس عزلات بكتيرية محللة للكيتين من ريزوسفير نباتات فلفل صحية تماما تم جمعها من إحدى المزراع التى تتبع الممارسات الزراعية الجيدة فى محافظة القليوبية. كما تم إستخدام وسط غذائى يحتوى على الكيتين كمصدر وحيد للكربون وذلك كبيئة إنتخابية لعزل الكائنات الدقيقة المحللة للكيتين.
2- تم إجراء إختبارات السلامة والأمان للعزلات البكتيرية وأظهرت جميع العزلات المختبرة خصائص آمنة للتطبيقات الزراعية.
3- تم التعريف الجزيئى لجميع العزلات المنتقاة بإستخدام تفاعل عديد البلمرة المتسلسل (.(PCRحيث تم عمل تتابع للأجزاء المعرفة من الجينات بجهاز تعريف التتابع. بعد ذلك تم إيداع تتابع القواعد النيتروجينية فى بنك الجينات العالمى، وأخذت تلك العزلات أرقام إيداع وتم مقارنتها بالعزلات الموجودة ببنك الجينات وعمل أشجار للقرابة.
4- تم التقدير الكمى لإفراز إنزيم الكيتينازفى جميع السلالات الميكروبية المعرفة، وتم تسجيل أعلى نشاط للكيتينازفى فطر التريكودرما أسبيريلم. كما كشف الإختبار الكمى للكيتيناز فروقات معنوية ملحوظة فى النشاط الإنزيمى بين العزلات المختبرة وبعضها.
5- لأغراض الدراسة المعملية تم عمل مزرعة نقية من نوع الميليدوجين إنكوجنيتا وذلك بإستخدام كيس بيض تم عزله من جذر مصاب من المزرعة المستهدفة ومن ثم تم حقنها فى تربة معقمة تحتوى على شتلات فلفل تحت ظروف الصوبة.
6- تم تحضير كل معاملة ميكروبية على حدا فى شكل خليط متنجانس من المزرعة الميكروبية و رواشح خالية من الخلايا الميكروبية، كلا منهم عند ثلاث تركيزات 20، 50، 100 ميكرون.
7- تحت ظروف المعمل تم إختبار قدرة المعاملات الميكروبية المختارة على تثبيط كلا من حيوية الطور اليرقى الثانى (الطور المعدى) وفقس بيض نوع الميليدوجين إنكوجنيتا.
8- سجلت التركيزات العالية من جميع المعاملات الميكروبية المختبرة قدرة كبيرة على تثبيط فقس بيض النيماتودا كما تسببت فى موت يرقات نيماتودا تعقد الجذور (ميليدوجين إنكوجنيتا). كما أثبتت التجارب المعملية العلاقة الطردية بين فاعلية المعاملات الميكروبية وتركيزها المستخدم وكذلك نشاط الكيتيناز فيها. وكانت التريكودرما أسبيريلم هي السلالة الميكروبية الأكثر فاعلية من حيث تثبيط فقس البيض وإحداث موت فى يرقات نيماتودا تعقد الجذور حتى عند تطبيقها بتركيز منخفض.
9- أظهرت الدراسات المجهرية ثلاثة أنماط من تشوه بيض النيماتودا على النحو التالي: ا) تحلل قشرة البيضة النيماتودية، ب) تطفل الجراثيم على قشرة البيضة ومحتوياتها الداخلية، ج) نمو الهيفات الفطرية على البيض. كما نجحت بعض السلالات البكتيرية كالسودومناس لينى والكليبسيلا أوكسيتا فى إحداث فقس مبكر للبيض وإحداث تشوهات ملحوظة فى الطور اليرقى الأول.
10- فى جميع المعاملات الميكروبية المختبرة كان تأثير الخليط المتجانس من المزرعة الميكروبية أكثر فاعلية ضد نيماتودا تعقد الجذور من الرواشح الخالية من الخلايا.
11- تم إجراء التجربة الحقلية فى مزرعة بوادى النطرون – محافظة البحيرة – مصر.
12- تم جمع ومعالجة قشور الجمبرى من مصادر بحرية لإستخدامها كمدخل عضوى إقتصادى فى خدمة التربة الزراعية وكمصدر عضوى لتنشيط وتثبيت المحتوى الميكروبى المحلل للكيتين.
13- تم تحضير السلالات الميكروبية المحللة كلا على حدا فى شكل خليط المزرعة المتجانس لإختبار قدرتها على تثبيط عدوى نيماتودا تعقد الجذور "نوع الميليدوجين إنكوجنيتا" فى نبات الفلفل تحت ظروف الحقل.
14- أظهرت نتائج التجارب الحقلية أن جميع العزلات الميكروبية التي تم إختبارها أدت إلى تنشيط المحتوى الميكروبى المحلل للكيتين في منطقة الجذور وعززت معايير النمو لنباتات الفلفل المعاملة مقارنة بالنباتات الغير معاملة. حيث سجلت التركودرما أسبريلم أعلى وزن للمجموع الخضري (260.00 جم)، وطول للمجموع الجذري (70.33 سم)، في حين سجلت السودوموناس لينى أقصى وزن للجذور.
15- نجحت المعاملات الميكروبية المختلفة فى تعظيم إنتاجية محصول الفلفل وتحسين خواص جودة الثمار من حيث المحتوى الكلى للسكريات والأسكوربيك أسيد.
16- أظهرت المعاملات الميكروبية المحللة للكيتين التي تم إختبارها فاعلية كبيرة في تثبيط الكثافة العددية الكلية لنيماتودا تعقد الجذور نوع الميليدوجين إنكوجنيتا في التربة والجذور، من بين المعاملات الميكروبية المختبرة، سجلت ترايكودرما أسبيريلم تليها لاكتوباسيلس هيلفاتيكس، أعلى قدرة على تثبيط التعداد الكلى لأفراد النيماتودا فى التربة والجذر. كذلك نجحت التريكورما أسبيريلم فى إحداث أعلى تثبيط لتكوين الأورام الجذرية (99.3%). كما أثرت جميع المعاملات بالسلب على خصوبة إناث نيماتودا تعقد الجذور والمتمثلة فى أعداد البيض لكل كتلة جيلاتينية.
17- أظهرت الدراسة التشريحية أن المعاملات الميكروبية لم تمنع بشكل كلى جميع أفراد الميليدوجين إنكوجنيتا من إختراق الجذور، ولكن أثرت المعاملات على قدرة اليرقات على الوصول إلى الأسطوانة الوعائية وتكوين الخلايا العملاقة وإكمال دورة الحياة. أظهرت القطاعات العرضية للجذور المعالجة بـالتريكودرما أسبيريلم و التريكودرما هازيانم و السودوموناس لينى و الاكتوباسيلس هيلفاتيكس مظهر صحى وندبات أقل مقارنة بالقطاعات العرضية للجذور الغير معاملة.
18- كشفت كلا من الدراسات المعملية والحقلية أن التريكودرما أسبيريلم كانت أفضل العزلات الميكروبية المختبرة فى تثبيطها للعدوى النيماتودية فى نبات الفلفل كما كانت من أفضل المعاملات فى تعزيز نمو النبات وتحسين إنتاجيته.
19- تم تعريف المركبات الثانوية التى ينتجها فطر التريكودرما أسبيريلم كنموذج مثالى لتطوير مبيد حيوى نيماتودى وذلك عن طريق استخلاص وترشيح مكونات البيئة النامى بها الفطر ثم حقنها بجهاز التحليل الكروماتوغرافى الغازى لقياس الطيف الكلى GC-Mass. وكان الهدف من التحليل معرفة مكونات الراشح من مركبات نشطة لها دور تازرى مع الكيتيناز فى مقاومة نيماتودا تعقد الجذور وتعزيز نمو النبات. وأتت النتائج بتعريف ستة عشر مركبا نشطا وتم تصنيف المركبات عن طريق الرجوع إلى الأبحاث السابقة والمنشورة دوليا على أنها مركبات متطايرة وأحماض عضوية ودهنية وفينولات وكان أغلبها يعمل كمضادات ميكروية ونيماتودية ومضادات أكسدة ومحفزات نمو.
Text in English and abstract in Arabic & English.
Pepper Plant
Meloidogyne incognita Biological Control Chitinolytic Microorganisms Chitinases Capsicum annuum L
583.952
Biochemical and Molecular Studies on Some Chitinolytic Microbial Isolates in Controlling Meloidogyne sp. in Pepper Plant/ /دراسات كيموحيوية وجزيئية على بعض العزلات الميكروبية المحللة للكيتين فى مقاومة نوع الميليدوجين فى نبات الفلفل Aya Abdalrahman Mohamed Abdellatif ; Supervisors : Prof. Dr. Tahany Mohamed Ali Abd-Elrahman, Prof. Dr. Mohsen Abou Elela Sayed Hamada, Prof. Dr. Atef Abd El-Aziz Hassan Ragab. - 184 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (Ph.D)-Cairo University, 2024.
Bibliography: pages 129-184.
Pepper is subjected to root-knot nematodes that affect its growth and
production. Field observation revealed that the most common symptoms on
naturally infected pepper were characteristic galls and lesions on root, followed
by wilting and stunting of whole plant. The results of this study could be
summarized as the following:
1. The aforementioned symptoms appeared in naturally infested pepper field
at Wadi El Natrun, Beheira Governorate, Egypt, were suspected of being
caused by Meloidogyne incognita and confirmed to be so by molecular
identification using Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)
marker system at Plant Pathology Institute, Agricultural Research Center,
Egypt.
2. On the other hand, five chitinolytic fungal isolates and five chitinolytic
bacterial isolates were isolated on chitin agar selective medium from
healthy pepper rhizosphere at Qalyubia Governorate in North-Eastern
Egypt using selective chitin agar medium.
3. Safety assessment for bacterial isolates was performed and all tested
isolates showed safe properties for agriculture applications.
4. Molecular characterization of the selected fungal and bacterial strains was
performed by polymerase chain reaction (PCR) amplification. Nucleotide
sequencing was used to detect and characterize the fungal isolates, using
the universal primers (ITS-1 and ITS-4), and bacterial isolates using the
universal primers (27F and 1492R). The characterized fungal isolates
were sequenced and submitted into Genebank under accession numbers
i.e., Trichoderma asperellum AF1 (OM760502), T. harzianum AF2
(OP159450), Aspergillus terreus AF3 (OM760510), Talaromyces
pinophilus AF4 (OM760509), T. simmonsii AF5 (OM918230). While, the
characterized bacterial isolates were sequenced and submitted into
Genebank
under
accession
numbers
i.e.,
Chryseobacterium
124
Summary and Conclusion
daecheongense AB1 (MZ148124), Bacillus toyonensis AB2 (MZ148324),
Pseudomonas lini AB3 (MZ148421), Lactobacillus helveticus AB4
(MZ148422), Klebsiella oxytoca AB5 (MZ148423).
5. All characterized microbial isolates were quantitively assayed for their
chitinase production. The highest chitinase activity (10.81 U/mL) and
specific activity (1.53 U/mg) were recorded for T. asperellum. Alo the
chitinase assay revealed that chitinas activity in microorganisms is strain
dependent.
6. Pure nematode culture raised from single egg mass of Meloidogyne
incognita isolated from the target field of pepper plant was used for
providing eggs and juveniles for in vitro study.
7. Three different concentrations (20, 50, and 100 µm) of both of
homogenized growth culture suspensions as well free cells culture filtrates
of the selected microbial isolates were tested against egg hatching and
juveniles vitality of Meloidogyne incognita. Lab experiments proved the
direct correlation between the efficacy of microbial treatments and their
concentration as well as their chitinase activity. T. asperellum was the
most effective microbial strain in suppression of Meloidogyne incognita
egg hatching and juveniles vitality even when used at low concentration.
8. The microscopic studies showed three patterns of egg disruption have
been observed as following: i) Lysis in egg shell, ii) Sporulated eggs, iii)
Hyphal growth on eggs. On the other hand, chitinolytic activity of
bacterial strains induced lysis in eggshell followed by prehatching and
coagulation of J1S.
9. To correlate between in vitro inhibitory action and in vivo activity of
various microbial treatments, the field experiment was performed in
naturally infested pepper field at Wadi El Natrun, Beheira Governorate,
Egypt.
125
Summary and Conclusion
10. Fresh exoskeletons of shrimp were collected and processed to be applied
as cost effective chitinous soil amendment.
11. Two days after transplantation of pepper seedlings, the cultivated soil was
irritated with liquid suspension of natural chitin powder (10 g/L) to act as
food base for chitinolytic microorganisms.
12. The different tested chitinolytic microbial strains were grown on modified
growth media supplemented with colloidal chitin as for induction of
microbial chitinases and were applied as homogenized growth culture
suspensions at dilution of 1:10 (Microbial culture: Tab water).
13. The results of field experiments revealed that all tested microbial isolates
increased the chitinolytic fungal and bacterial population in rhizosphere
and promoted the growth parameters of pepper plants compared to
untreated control. Trichoderma asperellum showed the maximum shoot
weight (260.00g), shoot length (70.33 cm) while Pseudomonas lini and
Lactobacillus helveticus recorded the maximum root length (32.67 and
32.00 cm, respectively).
14. Also, the tested biocontrol agents showed positive impact on pepper yield
and promoted various parameters of fruit quality. The highest total pepper
yield (235.00 g/ plant) was achieved in plants treated by Trichoderma
asperellum. Regarding the fruit quality parameters, the fruits of plants
treated by T. asperellum showed the best quality in terms of total sugars
content (5.54%) and ascorbic acid content (55.73 mg/100g FW).
15. tested chitinolytic microbial agents were significantly effective in
suppressing the final population densities of Meloidogyne incognita in soil
and root relative to untreated check. However, among microbial
treatments, Trichoderma asperellum followed by Lactobacillus helveticus
recorded the highest reduction in M. incognita final population (86.60 and
86.21, % respectively).
126
Summary and Conclusion
16. All chitinolytic microbial treatments achieved remarkable reduction in
root galling and egg masses development. Furthermore, the number of
eggs/egg mass, an indicator for female fertility, was affected negatively
by most of tested treatments. The minimum numbers of galls were
recorded in roots treated with Trichoderma asperellum, T. simmonsii and
T. harzianum amounted to 93.93, 93.93 and 91.65% reduction relative to
untreated control. Bacillus toyonensis showed the minimum reduction in
gall formation (46.97%).
17. The anatomical study revealed that all treatments did not prevent M.
incognita from penetrating the roots but different time was required to
reach the vascular cylinder to develop giant cells and to complete life
cycle. The transverse sections of roots treated with Trichoderma
asperellum, T. harzianum, Pseudomonas lini and Lactobacillus helveticus
showed the healthiest pattern and less necrotic points compared to
untreated control.
18. In vitro and in vivo studies revealed that Trichoderma asperellum was the
most effective chitinolytic microbial strain against Meloidogyne
incognita.
19. Characterization of Trichoderma asperellum was performed using Gas
chromatography-mass spectrometry (GCMS) analysis of the crude
extracts. GC-Mass analysis resulted in presence of 16 active compounds.
In peak four and six, Malic acid, 3TMS derivative (3.09%) and Tartaric
acid, 4TMS derivative (5.68 %) are important organic acids that showed
antinematode effect while s-Triazine trichloride is the major compound in
peak nine (31.93%) and has potent toxicity against many pathogenic fungi
and have antioxidant activity. يعتبر الفلفل من المحاصيل الهامة للإستهلاك المحلى وذلك لقيمته الغذائية العالية كمصدر هام للمعادن والفيتامينات، وكذلك يعتبر ذات ميزة تنافسية لمصر فى الأسواق العالمية والتصديرية. يعد نبات الفلفل أحد أهم العوائل للنيماتودا الممرضة للنبات لا سيما نيماتودا تعقد الجذور. وأثناء عملية الفحص بمنطقة وادى النطرون بمحافظة البحيرة لوحظ أعراض إصابة نيماتودية متمثلة فى ظهور عقد جذرية (أورام) مختلفة الأحجام فى منطقة الجذور. ومع تقدم الإصابة ظهرت أعراض التقزم والذبول الشديد على المجموع الخضرى التى إنتهت بموت النباتات المصابة فى فترة زمنية قصيرة. تم جمع عينات من جذور النباتات المصابة ومن ثم تم التعريف المعملى للمسبب المرضى بنوع الميليدوجين إنكوجنيتا.
يساهم الإستخدام الجائر للمبيدات الكيميائية فى علاج أمراض التربة الشرسة ومنها نيماتودا تعقد الجذور فى ظاهرة الإحتباس الحرارى والتغيرات المناخية التى يعانى منها كوكب الأرض فى الاونة الأخيرة. هذا وقد إستهدفت الدراسة الحالية عزل وتعريف وتطوير الكائنات الحية الدقيقة المحللة للكيتين كمبيدات حيوية فعالة وامنة على البيئة لمكافحة نيماتودا تعقد الجذور حيث تم تطبيقها معمليا وحقليا للوقوف على دورها الحيوى وتأثيرها التضادى فى مكافحة المسبب المرضى.
ويمكن تلخيص النتائج المتحصل عليها فيما يلى:
1- تم عزل خمس عزلات فطرية محللة للكيتين وخمس عزلات بكتيرية محللة للكيتين من ريزوسفير نباتات فلفل صحية تماما تم جمعها من إحدى المزراع التى تتبع الممارسات الزراعية الجيدة فى محافظة القليوبية. كما تم إستخدام وسط غذائى يحتوى على الكيتين كمصدر وحيد للكربون وذلك كبيئة إنتخابية لعزل الكائنات الدقيقة المحللة للكيتين.
2- تم إجراء إختبارات السلامة والأمان للعزلات البكتيرية وأظهرت جميع العزلات المختبرة خصائص آمنة للتطبيقات الزراعية.
3- تم التعريف الجزيئى لجميع العزلات المنتقاة بإستخدام تفاعل عديد البلمرة المتسلسل (.(PCRحيث تم عمل تتابع للأجزاء المعرفة من الجينات بجهاز تعريف التتابع. بعد ذلك تم إيداع تتابع القواعد النيتروجينية فى بنك الجينات العالمى، وأخذت تلك العزلات أرقام إيداع وتم مقارنتها بالعزلات الموجودة ببنك الجينات وعمل أشجار للقرابة.
4- تم التقدير الكمى لإفراز إنزيم الكيتينازفى جميع السلالات الميكروبية المعرفة، وتم تسجيل أعلى نشاط للكيتينازفى فطر التريكودرما أسبيريلم. كما كشف الإختبار الكمى للكيتيناز فروقات معنوية ملحوظة فى النشاط الإنزيمى بين العزلات المختبرة وبعضها.
5- لأغراض الدراسة المعملية تم عمل مزرعة نقية من نوع الميليدوجين إنكوجنيتا وذلك بإستخدام كيس بيض تم عزله من جذر مصاب من المزرعة المستهدفة ومن ثم تم حقنها فى تربة معقمة تحتوى على شتلات فلفل تحت ظروف الصوبة.
6- تم تحضير كل معاملة ميكروبية على حدا فى شكل خليط متنجانس من المزرعة الميكروبية و رواشح خالية من الخلايا الميكروبية، كلا منهم عند ثلاث تركيزات 20، 50، 100 ميكرون.
7- تحت ظروف المعمل تم إختبار قدرة المعاملات الميكروبية المختارة على تثبيط كلا من حيوية الطور اليرقى الثانى (الطور المعدى) وفقس بيض نوع الميليدوجين إنكوجنيتا.
8- سجلت التركيزات العالية من جميع المعاملات الميكروبية المختبرة قدرة كبيرة على تثبيط فقس بيض النيماتودا كما تسببت فى موت يرقات نيماتودا تعقد الجذور (ميليدوجين إنكوجنيتا). كما أثبتت التجارب المعملية العلاقة الطردية بين فاعلية المعاملات الميكروبية وتركيزها المستخدم وكذلك نشاط الكيتيناز فيها. وكانت التريكودرما أسبيريلم هي السلالة الميكروبية الأكثر فاعلية من حيث تثبيط فقس البيض وإحداث موت فى يرقات نيماتودا تعقد الجذور حتى عند تطبيقها بتركيز منخفض.
9- أظهرت الدراسات المجهرية ثلاثة أنماط من تشوه بيض النيماتودا على النحو التالي: ا) تحلل قشرة البيضة النيماتودية، ب) تطفل الجراثيم على قشرة البيضة ومحتوياتها الداخلية، ج) نمو الهيفات الفطرية على البيض. كما نجحت بعض السلالات البكتيرية كالسودومناس لينى والكليبسيلا أوكسيتا فى إحداث فقس مبكر للبيض وإحداث تشوهات ملحوظة فى الطور اليرقى الأول.
10- فى جميع المعاملات الميكروبية المختبرة كان تأثير الخليط المتجانس من المزرعة الميكروبية أكثر فاعلية ضد نيماتودا تعقد الجذور من الرواشح الخالية من الخلايا.
11- تم إجراء التجربة الحقلية فى مزرعة بوادى النطرون – محافظة البحيرة – مصر.
12- تم جمع ومعالجة قشور الجمبرى من مصادر بحرية لإستخدامها كمدخل عضوى إقتصادى فى خدمة التربة الزراعية وكمصدر عضوى لتنشيط وتثبيت المحتوى الميكروبى المحلل للكيتين.
13- تم تحضير السلالات الميكروبية المحللة كلا على حدا فى شكل خليط المزرعة المتجانس لإختبار قدرتها على تثبيط عدوى نيماتودا تعقد الجذور "نوع الميليدوجين إنكوجنيتا" فى نبات الفلفل تحت ظروف الحقل.
14- أظهرت نتائج التجارب الحقلية أن جميع العزلات الميكروبية التي تم إختبارها أدت إلى تنشيط المحتوى الميكروبى المحلل للكيتين في منطقة الجذور وعززت معايير النمو لنباتات الفلفل المعاملة مقارنة بالنباتات الغير معاملة. حيث سجلت التركودرما أسبريلم أعلى وزن للمجموع الخضري (260.00 جم)، وطول للمجموع الجذري (70.33 سم)، في حين سجلت السودوموناس لينى أقصى وزن للجذور.
15- نجحت المعاملات الميكروبية المختلفة فى تعظيم إنتاجية محصول الفلفل وتحسين خواص جودة الثمار من حيث المحتوى الكلى للسكريات والأسكوربيك أسيد.
16- أظهرت المعاملات الميكروبية المحللة للكيتين التي تم إختبارها فاعلية كبيرة في تثبيط الكثافة العددية الكلية لنيماتودا تعقد الجذور نوع الميليدوجين إنكوجنيتا في التربة والجذور، من بين المعاملات الميكروبية المختبرة، سجلت ترايكودرما أسبيريلم تليها لاكتوباسيلس هيلفاتيكس، أعلى قدرة على تثبيط التعداد الكلى لأفراد النيماتودا فى التربة والجذر. كذلك نجحت التريكورما أسبيريلم فى إحداث أعلى تثبيط لتكوين الأورام الجذرية (99.3%). كما أثرت جميع المعاملات بالسلب على خصوبة إناث نيماتودا تعقد الجذور والمتمثلة فى أعداد البيض لكل كتلة جيلاتينية.
17- أظهرت الدراسة التشريحية أن المعاملات الميكروبية لم تمنع بشكل كلى جميع أفراد الميليدوجين إنكوجنيتا من إختراق الجذور، ولكن أثرت المعاملات على قدرة اليرقات على الوصول إلى الأسطوانة الوعائية وتكوين الخلايا العملاقة وإكمال دورة الحياة. أظهرت القطاعات العرضية للجذور المعالجة بـالتريكودرما أسبيريلم و التريكودرما هازيانم و السودوموناس لينى و الاكتوباسيلس هيلفاتيكس مظهر صحى وندبات أقل مقارنة بالقطاعات العرضية للجذور الغير معاملة.
18- كشفت كلا من الدراسات المعملية والحقلية أن التريكودرما أسبيريلم كانت أفضل العزلات الميكروبية المختبرة فى تثبيطها للعدوى النيماتودية فى نبات الفلفل كما كانت من أفضل المعاملات فى تعزيز نمو النبات وتحسين إنتاجيته.
19- تم تعريف المركبات الثانوية التى ينتجها فطر التريكودرما أسبيريلم كنموذج مثالى لتطوير مبيد حيوى نيماتودى وذلك عن طريق استخلاص وترشيح مكونات البيئة النامى بها الفطر ثم حقنها بجهاز التحليل الكروماتوغرافى الغازى لقياس الطيف الكلى GC-Mass. وكان الهدف من التحليل معرفة مكونات الراشح من مركبات نشطة لها دور تازرى مع الكيتيناز فى مقاومة نيماتودا تعقد الجذور وتعزيز نمو النبات. وأتت النتائج بتعريف ستة عشر مركبا نشطا وتم تصنيف المركبات عن طريق الرجوع إلى الأبحاث السابقة والمنشورة دوليا على أنها مركبات متطايرة وأحماض عضوية ودهنية وفينولات وكان أغلبها يعمل كمضادات ميكروية ونيماتودية ومضادات أكسدة ومحفزات نمو.
Text in English and abstract in Arabic & English.
Pepper Plant
Meloidogyne incognita Biological Control Chitinolytic Microorganisms Chitinases Capsicum annuum L
583.952