Investigating some micro-RNAs expression profiles in HCV Egyptian patients / By Hameis Mohamed Abd El Rahman Sleem ; Supervised by Manal Fouad Ismail, Nagwa Ibrahim Shehata, Abdullah Gibriel.

Thesis (Ph.D)-Cairo University,2022.

Bibliography: p. 120-103.

يعتبر التهاب الكبد الوبائي ” ج ” مشكلة صحية عالمية ، حيث يصاب به حوالي 3 ٪ من سكان العالم و يعد فيروس الكبد الوبائى )ج( واحد من فيروسات الحمض النووي الريبوزي سريعة التغير مما يؤدى الى التباين الجينى الملحوظ بين المصابين بالمرض، في الوقت الحاضر ، تم تصنيف فيروس التهاب الكبد ) ج( إلى أحد عشر نمطًا وراثيًا، يعتبر سبعة منها هي الأنماط الرئيسية ، مع انتشار مختلف لتلك الأنماط في جميع أنحاء العالم وقد تم العثور على النمط الجيني الرابع في مصر وإفريقيا الوسطى ومنطقة البحر الأبيض المتوسط والشرق الأوسط . يتطور الأمر مع ما يقرب من 20 % من المرضى المصابين بالالتهاب الكبدي الوبائي المزمن إلى المرحلة النهائية من المرض الكبدي وتتمايز الإصابة المزمنة بفيروس التهاب الكبد الوبائي )ج( بشكل كبير وتختلف بين الأفراد من جهة تطور المرض ، وعلى الرغم من أن العديد من المصابين بالفيروس لم يتطور الأمر معهم إلى حدوث تليف في الكبد إلا أن البعض منهم قد يتطور الأمر معهم الى حدوث تليف مزمن وقد ارتبط عدد من العوامل الخلوية والخصائص الديموغرافية والسريرية فضلًا عن العوامل الفيروسية بتطور حدوث تليف الكبد المرتبط بالالتهاب الكبدي الوبائي ،ان تليف الكبد هو عبارة عن تراكم بشكل مفرط للبروتينات في نسيج خارج الخلية، ومن بين هذه البروتينات الكولاجين الذي يُعد إفرازه بشكل متزايد سببًا في حدوث إصابة مزمنة للكبد، يعد تصنيف مراحل تليف الكبد أمرًا ضروريًا لإدارة وتشخيص حالات المرضى الذين يُعانون من التهاب الكبد الوبائي المزمن الذين يتوقع أن يرتفع عددهم خلال العقود المقبلة مما يُشكل تحديًا كبيرًا للرعاية الطبية . تُشكل الإصابة لفترات طويلة بفيروس التهاب الكبد )ج( أيضًا خطرًا كبيرًا على تطور الأمر إلى الإصابة بسرطان الخلايا الكبدية و يعتبر الكبد الوبائي ) ج( هو العامل الرئيسي المسبب لسرطان الخلايا الكبدية وذلك من خلال الدورة غير المباشرة التالية: التهاب مزمن ثم موت الخلايا ثم انتشار وتفشي المرض و يعتبر سرطان الخلايا الكبدية هو خامس أنواع السرطان الأكثر انتشارًا وهو السبب الثالث الأكثر شيوعًا لحدوث الوفيات بالسرطان في العالم، كما إنه السبب الرئيسي للوفاة لمرضى الالتهاب الكبدي المزمن والمتسبب في حدوث مليون حالة وفاة كل عام ومن المتوقع أن يزداد معدل الإصابة بسرطان الخلايا الكبدية في العقدين القادمين، ويرجع ذلك إلى انتشا ر كبير في الإصابة بالالتهاب الكبدي )ج( وتليف الكبد، لذا يُعد اكتشاف سرطان الخلايا الكبدية في مرحلة مبكرة أمرًا حاسمًا للحصول على نتائج سريرية إيجابية. يتكون الحمض النووي الريبوزي متناهي الصغرمن وحدات صغيرة من الحمض النووي الريبوزي ) 22 من النيوكليوتيدات ( احادية الضفيرة غير مشفرة ذات شكل ثانوى دبوسى ، حيث تعمل على تنظيم عملية تثبيط الجينات إما عن طريق استهداف الحمض النووي الريبوزي المرسال ) ام ار ان ايه( بشكل مباشر أو عن طريق وقف الترجمة وقد ارتبط التعبير غير المنضبط للحمض النووي الريبوزي متناهي الصغر بحدوث أنواع مختلفة للسرطان من بينها سرطان الخلايا الكبدية. ذكرت عدة مجموعات بحثية أن وجود الحمض النووي الريبوزي متناهي الصغر في مصل و بلازما الدم يطلق عليها الأحماض النووية الريبوزية متناهية الصغرفى الدم و قد تبين انها لا تتأثر بإنزيمات الريبونيوكلياز الموجودة في الدم، وبالإضافة إلى ذلك فإن الأحماض النووية الريبوزية متناهية الصغر فى الدم تظهر سمات متسقة بين الأفراد الأصحاء وكذلك مستوى كبير من التغير في حالات الأمراض وتعتبر هذه الصفات التى تتسم بها الأحماض النووية الريبوزية متناهية الصغر فى الدم كمؤشرات حيوية للتغيرات في الظروف الفسيولوجية والمرضية فعلى سبيل المثال يظهر لنا أن الميكرو ار ان ايه- 25 و الميكرو ار ان ايه- 223 على أنهما مؤشرات حيوية في الدم للإصابة بسرطان الرئة ، ويظهر الميكرو ار ان ايه- 184 مؤشر على سرطان الخلايا الحرشفية ، ويظهر الميكرو ار ان ايه- 92a مؤشر على سرطان الدم.

حددت الدراسات الحديثة عددًا من الأحماض النووية الريبوزية متناهية الصغرالتي تلعب دورًا كبيرًا في تفاعل الفيروس مع الجسم والتي تنظم تكاثر الفيروس و احداثه للمرض اُثناء الإصابة بفيروس الالتهاب الكبدي الوبائي)ج( ومن بين التحديات الرئيسية في الأبحاث التي تُجرى على التهاب الكبد الوبائي )ج( هو الكشف في مرحلة مبكرة عن أمراض الكبد مما يسمح بالتدخل السريع وتحسين نتائج العلاج بمضادات الفيروس، كما ان هناك حاجة إلى تطوير الوسائل غير الجراحية على الأقل لتقييم شدة المرض ومستوى تقدمه، لذا قد تكون الأحماض النووية الريبوزية متناهية الصغر فى الدم ذات فائدة محتملة كمؤشرات حيوية للكشف والتنبؤ بتقدم أمراض الكبد المرتبطة بالإصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي)ج(يكمن الهدف الرئيسي من وراء الدراسة الحالية في دراسة انماط التعبير الجينى فى بلازما الدم للأحماض النووية الريبوزية متناهية الصغرالاتية ) الميكرو ار ان ايه- 650 و الميكرو ار ان ايه- 512-5p و الميكرو ار ان ايه- 552-3p و الميكرو ار ان ايه- 147 و الميكرو ار ان ايه 3p- - 676 ( في مراحل مختلفة من الاضطرابات الكبدية المرتبطة بفيروس الالتهاب الكبدي الوبائي )ج( بين المرضى المصريين في محاولة لتحديد الوسائل غير الجراحية المحتملة من أجل التشخيص المبكر وتحديد مراحل المرض ولقد بحثنا أيضًا في كيفية تأثير الميكرو ار ان ايه 3p - 676 على انماط التعبير عن مختلف الجينات المستهدفة المحتملة ، بما في ذلك ا.ك.ت ) Akt ( و بيتا-كاتينين) β-catenin ( و عامل النخر الورمى-الفا) TNF-α ( وبروتين الصدمة الحرارية- 90 الفا ) Hsp90α ( وان.اف.اى- 2 ( NFE2 ( وبى- 53 ( p53 ( ومنشظ مخلق الجليكوجين- 3β ( GSK-3β ( وكاسبيز- 7 (CASP7) و نوكس- 4 ( Nox4 ( وانترلوكين- 6 ( IL- 6 ( و عامل النمو المحول-بيتا) TGF-β ( في خلايا سرطان الكبد. شملت هذه الدراسة 127 مريضًا مصريًا بفيروس التهاب الكبد الوبائي ) ج( في مراحل مختلفة ) 26 تليفًا خفيفًا و 22 تليفًا متقدمًا ، 39 مصابًا بتليف الكبد و 40 شخصًا من مرضى سرطان الخلايا الكبدية( و 40 من الأصحاء و تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المشاركين وتمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بكلية الصيدلة جامعة القاهرة )رقم الموافقة: BC2116 (، وتم إجراء الدراسة بالتوافق مع إعلان هيلسنكي، وكانت معايير الاشتمال لهذه الدراسة ؛السن أكبر من 18 عامًا مصابًا بعدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي)ج(و قد تم استبعاد المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد المزمن أو تليف الكبد غير المرتبط بالأصابة بالتهاب الكبد الفيروسي)ج( والمرضى الذين يعانون من أي ورم خبيث آخر غير سرطان الخلايا الكبدية من هذه الدراسة وتم التأكد من الإصابة بالفيروس إما عن طريق إجراء اختبار تفاعل البلمرة المتسلسل لقياس الحمل الفيروسي أو من خلال قياس أجسام مضادة للالتهاب الكبدي الوبائي )ج( وتم تشخيص مراحل تليف الكبد باستخدام FibroScan و تم تشخيص سرطان الخلايا الكبدية من خلال إجراء موجات صوتية على البطن والتي تم التأكد من نتائجها من خلال التصوير المقطعي و/ أو التصوير بالرنين المغناطيسي، كما تم إجراء اختبار ألفا فيتو بروتين مع مراعاة المؤشرات البيوكيميائية مثل أنزيمات ناقلة أمين الألانين وناقلة أمين الأسبارتات والألبيومين والبيليروبين ومستوى إنزيم الفوسفتاز القلوي. تم استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبوزي )ار ان ايه( من البلازما باستخدام مجموعة Direct-zol ™ RNA MiniPrep و قبل خطوة ترسيب الإيثانول ، تم استخدام cel-miR-39-3p كزيادة في التحكم لجميع العينات و قد تم تحديد كمية عينات الحمض النووي الريبوزي )ار ان ايه( المستخلصة باستخدام Nanodrop Q5000 UV-Vis ثم تم استخدام 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبوزي بعد ان تم تحويله الى متعدد الأدينين باستخدام E. coli Poly (A) Polymerase و تبع ذلك النسخ العكسي باستخدام مجموعة GoScript Reverse Transcription ثم تم تنفيذ تفاعل البلمرة المتسلسل اللحظي باستخدام GoTaq® qPCR master Mix و لضمان التحديد الكمي الدقيق للأحماض النووية الريبوزية متناهية الصغر التي تم فحصها ولتجنب التضخيم غير المحدد للبادئات المصممة ، تم إجراء تحليل لمنحنى الأنصهار بعد اجراء كل تفاعل بلمرة متسلسل ، كما تم استخدام الصيغة ΔΔCt-2 لحساب التعبيرالجينى النسبى و التغيير الضعفى للأحماض النووية الريبوزية متناهية الصغر. بالإضافة إلى ذلك ، تم نقل الميكرو ار ان ايه 3p- - 676 إلى نوعين مختلفين من خطوط خلايا سرطان الكبد ( HepG2 و Huh-7 ( باستخدام lipofectamine 3000 ثم تم استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل اللحظي للكشف عن مستوى الميكرو ار ان ايه -3p - 676 و الحمض النووي الريبوزي المرسال للجينات المستهدفة و قد أظهرت نتائج التجارب التي أجريت في المختبر أنه في خلايا سرطان الكبد، أثر الميكرو ار ان ايه 3p- - 676 على التعبير عن العديد من الجينات المسرطنة والجينات الكابتة للورم بشكل ملحوظ ، من خلال خفض التعبير الجينى لكل من ا.ك.ت و بيتا-كاتينين و عامل النخر الورمى-الفا وبروتين الصدمة الحرارية- 90 الفا وان.اف.اى- 2. علاوة على ذلك ، فقد قام بزيادة التعبير الجينى لكل من بى- 53 ومنشظ مخلق الجليكوجين- 3β وكاسبيز- 7 بشكل كبير،و من ناحية أخرى فقد بقيت مستويات التعبيرالجينى لكل