A phytochemical and biological study of phyllanthus niruri l. / by Ola Essam Abdelhamid Abdel-Sattar ; supervision of Prof. Dr. Meselhy Ragab Meselhy , Prof. Dr. Ali Mahmoud EL-Halawany , Dr. Rasha Mosa Allam

Thesis (M.Sc.)-Cairo University, 2023.

Bibliography: pages 145-149.

In the current study, a method for the preparation of extract rich in phyllanthin and related lignans from the aerial parts of P. niruri L. was developed by applying conventional and nonconventional methods. Direct extraction with solvents produced extracts with variable contents but low yield of lignans. The extraction quality and efficiency were optimized by adopting three different approaches; 1)- pre-alkaline digestion of the plant material with 30% potassium hydroxide, 2)- microwave-assisted extraction using 80% MeOH, and 3)- pre-treatment of the ground plant material with two hydrolytic enzymes; cellulase and then protease.
The potential cytotoxicity of P. niruri extracts and fractions alone and combined with doxorubicin (DOX) against both naïve (MCF-7) and doxorubicin-resistant breast cancer cell lines (MCF-7ADR) was evaluated. The methylene chloride fraction (CH2Cl2) of the MeOH extract showed the most cytotoxic activity among all tested fractions and enhanced the cytotoxic effect of DOX against both cell lines. Its B2 subfraction showed selective cytotoxicity against resistant breast cancer cells. B2 in equitoxic combination with DOX exerted a potent synergism with an IC50 value of 0.03 ± 0.001 µg/mL vs 9.90 ± 1.30 µg/mL for DOX alone on MCF-7ADR. Chemical profiles of the MeOH extract and the active CH2Cl2 fraction were characterized using LC-DAD-QTOF-MS/MS. Active compounds; β-sitosterol (PN1); nirtetralin (PN2), niranthin (PN3), hypophyllanthin (PN4), and phyllanthin (PN5) were isolated from the B2 subfraction and their potential anticancer activities were elucidated in parties. Only PN4 and PN5 showed more cytotoxic activity against MCF-7ADR cells with IC50’s values equal to 58.70 ± 1.2 µM and 29.50 ± 0.9, respectively, as well as showing potent synergistic interactions when combined with DOX on MCF-7ADR. Specifically, PN5 combination with DOX markedly decreased IC50 of DOX from 17.00 μM to 1.10 μM. Their impacts alone and combined with DOX on programmed/non-programmed cell death (apoptosis, autophagy/necrosis), cell cycle progression/arrest, and tumor cell migration/invasion were investigated. The chemomodulatory effect of both compounds with DOX was found to be higher than their anticancer activities. The chemomodulatory effect of both compounds to DOX was found to be via potentiating DOX-induced cell cycle interference and apoptosis induction via blocking apoptosis-escape autophagy pathway in MCF-7ADR. On the molecular level, both compounds interfered with SIRT1 expression and consequently suppressed Akt phosphorylation.
These findings explained the antiproliferative and cytotoxic potential of both compounds. Furthermore, hypophyllanthin and phyllanthin showed a promising anti-migratory and anti-invasive effect against MCF-7ADR as confirmed by suppression of N-cadherin/β-catenin expression. To the best of our knowledge, this is the first study on the anticancer/ chemomodulatory activities of hypophyllanthin and phyllanthin in MCF-7ADR investigating their mechanism of action

مركب الفيلانثين ومشتقاته ذات الصلة تعتبر مسؤولة ، على الأقل جزئيًا ، عن معظم التأثيرات الحيوية لجنس الفيلانثوس ولطالما استخدمت نباتات من جنس فيلانثوس فى الطب الشعبى في علاج الكثير من الأمراض، وفى التجارب المعملية أظهرت خلاصاتها نشاطًا ملحوظا ضد انتشار الخلايا السرطانية البشرية.
نظرًا لأهمية مركبات الليجنان من نوعية الفيلانثين، تم تصميم هذه الدراسة لتطوير طريقة لتحضير مستخلص غني بالفيلانثين ومشتقاته ذات الصلة من الأجزاء الهوائية لنبات P. niruri L..
حيث وجد أن الاستخلاص المباشر بالمذيبات المعروفة انتجت مستخلصات ذات إنتاجية ومحتويات متغيرة من مركبات الليجنان. أعطت عملية مستخلص بنسبة 3.6٪ وزن / وزن مع محتوى منخفض من فيلانثين (3.1 مجم / جم مستخلص) ، تم تحديده بواسطة جهاز HPLC. وكذلك ، فإن الاستخلاص باستخدام جهاز soxhlet بواسطة الهكسان أو CH2Cl2 أو الأسيتون أعطى مستخلصات ذات إنتاجية منخفضة (0.82 و 1.12 و 3.40 جم٪ وزن / وزن على التوالي) ومحتوى فيلانثين أعلى يبلغ 36.2 ± 2.6 و 11.7 ± 1.68 و 11.7 ± 1.10 مجم / جم ، على التوالى. من ناحية أخرى ، تم تحسين جودة الاستخلاص وكفاءته من خلال الاعتماد على ثلاثة بروتوكولات مختلفة : 1) – المعالجة القلويه للمادة النباتية مع 30٪ هيدروكسيد البوتاسيوم ينتج 3.1 جم٪ وزن / وزن من المستخلص المنقى الذي يحتوي على نسبة عالية من الفيلانثين (22.34 ± 0.13 مجم / جم) ؛ و 2) - الاستخلاص بمساعدة فرن الميكروويف باستخدام 80٪ الكحول الميثيلى أعطى خلاصة ذات انتاجية أفضل (8.13 جم٪ وزن / وزن) ومحتوى فيلانثين يبلغ 21.2 ± 1.30 مجم / جم (بعد الترشيح من خلال عمود Diaion HP-20) ؛ بينما 3) - معالجة البودرة النباتية للأجزاء الهوائية عند 50 درجة مئوية باستخدام خليط من كل من إنزيم: السليوليز (9 U / جم لمدة 12 ساعة) و البروتييز (4U / جم حتى 72 ساعة) قد كان العائد الأمثل للمستخلص (13.92 جم٪ وزن / وزن) ومحتوى فيلانثين (25.9 مجم / جم مستخلص ، إجمالي محتوى الليجنان 85.87 مجم / جرام من المستخلص). في الختام فقد وجد أن الطرق غير التقليدية المعروضة هنا متفوقة في تحسين إنتاجية المستخلص ومحتويات اليجنان من الأجزاء الهوائية لـ P. niruri.
و من المعلوم أن سرطان الثدي من أكثر أنواع السرطان تشخيصًا ويعتبرسببًا رئيسيًا للوفاة من السرطان بين النساء، كما أن عقارDoxorubicin (DOX) هو علاج ناجع كمضاد للسرطان و يستخدم فى بروتوكولات علاج سرطان الثدي على الرغم من العديد من الأضرار الجانبية التى تنتح من طول استخدامة والسمية الكبيرة على عضلة القلب إلى جانب الزيادة الناتجة فى مقاومة الخلايا السرطانية لتأثيره.
هذا وقد اظهرت خلاصة الأجزاء الهوائية لـ P. niruri نشاطًا مضادًا لتكاثرخلايا الثدى السرطانية ، لذلك فقد تم دراسة السمية الخلوية المحتملة لمستخلصات P. niruri بمفردها وفى وجود DOX ضد خلايا (MCF-7) وخطوط خلايا سرطان الثدي المقاومة للDOX ( MCF-7ADR) ، حيث أظهر جزء المستخلص من كلوريد الميثيلين (CH2Cl2) نشاطا أكثر سمية للخلايا بين جميع المستخلصات المختبرة. ومن المثير للاهتمام أن جزء CH2Cl2 كان أكثر سمية للخلايا ضد MCF-7ADR من MCF-7 عند 100 ميكروغرام / مل. في التركيزات السامة للخلايا الفرعية ، و عزز هذا الجزء التأثير السام للخلايا لـ DOX ضد كلا خطوط الخلايا قيد الاختبار. علاوة على ذلك ، أظهر تجزئة TLC أن الجزء B2 في تركيبة متساوية السمية مع DOX له تأثيرا قويًا (قيم IC50 تبلغ 0.03 ميكروغرام / مل مقابل 9.9 ميكروغرام / مل لـ DOX وحده) داخل MCF-7ADR.
تم إجراء تحليل للمركبات الأيضية غير المستهدفة في مستخلص الميثانول الخام (MeOH) وجزء كلوريد الميثيل (CH2Cl2) الذي يظهر نشاط سمية محتمل باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء مع الكشف بالأشعة فوق البنفسجية وطيف الكتلة مع الكوادروبول تايم أوف فلايت (LC-DAD-QTOF) و MS/MS.
كما تم إجراء مزيد من الدراسات لفصل المركبات النشطة من جزء CH2Cl2 ولتوضيح آلية عملها.
و نتيجة تعريض جزء CH2Cl2 النشط للفصل كروماتوجرافي طبيعي وأعمدة هلام السيليكا RP-18 تم فصل خمسة مركبات، وتم التعرف على بنيتها الكيميائية على أنها β-sitosterol (1PN) و nirtetralin (2 PN) و niranthin (3 PN) و hypophyllanthin (PN4) و phyllanthin (PN5). و من بين المركبات التي تم اختبارها (PN1-PN5) ، أظهر فقط هيبوفيلانثين (PN4) ، وفيلانثين (PN5) نشاطًا أكثر سمية ضد خلايا MCF-7ADR بقيم IC50 كانت تساوي 58.7 ± 1.2 ميكرومتر و 29.5 ± 0.9 ، على التوالي. وأظهر كلا المركبين تفاعلًا تآزريًا قويًا ، خاصةً مركب رقم-5 على MCF-7ADR. وقد أدى الجمع بين السمية المتساوية لـ PN4 أو PN5 مع DOX إلى تحسين المظهر السام للخلايا لـ DOX بشكل ملحوظ ، مما قلل من قيمة IC50 من 17 ± 1.9 ميكروجرام إلى 9.5 ± 0.6 ميكروجرام و 1.1 ± 0.03 ميكروجرام ، على التوالي.
كما لم يظهر تقييم التدفق الخلوي للحمض النووي للمركب PN4 أي تغيير كبير في عدد الخلايا في طور G0 / G1 و S مقارنة بخلايا التحكم ، وقلل بشكل كبير من عدد الخلايا في طور G2 / M مع مضاعفة عدد الخلايا في مرحلة ما قبل -G ، بينما أظهر المركب PN5 تغيرات كبيرة في جميع المراحل. تسبب الجمع بين DOX و PN4 في تأثير مضاد للتكاثر قوي جدًا مقارنة بـ DOX. بالمقارنة مع DOX وحده ، تسبب الجمع بين DOX و PN4 في حدوث نخر كبير ، في حين أن الجمع بين DOX مع PN5 قد تسبب في الموت المبرمج للخلايا بشكل كبير ، دون تغيير النسبة المئوية للنخر المستحث بواسطة DOX وحده. بالإضافة إلى ذلك ، خففت معالجة PN4 و PN5 جنبًا إلى جنب مع DOX بشكل ملحوظ الحث الذاتي لـ DOX بنسبة 37 ٪ و 40 ٪ على التوالي ، مما يشير إلى قدرة كل من PN4 و PN5 على تقليل مقاومة الخلايا السرطانية MCF-7ADR لعقار DOX وذلك عن طريق تثبيط الالتهام الذاتي. علاوة على ذلك ، تعزيز تأثير ال DOX بشكل ملحوظ لمستوى التعبير عن الالتهام الذاتي لهذة الخلايا.

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.