Thesis (Ph.D)-Cairo University, 2023.

Bibliography: pages 79-94.

Bacterial ghost cells (BGCs) are evacuated bacterial cells from genetic and cytoplasmic materials. This study designed to produce four versions of BGCs; for the first time Gram-positive Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) BGCs were produced by treatment with Tween 80 (TW80) or TritonX-100 (TX100) and tested for their immunogenicity in mice. Likewise, was performed for Gram-negative Shigella flexneri (S. flexneri) BGCs. The successful production of all versions of BGCs was confirmed using scanning electron microscopy, measuring DNA and protein; and re-cultivation of treated cells. Immunogenicity was tested for both models through intra-nasal and intraperitoneal immunization doses followed by infection with S. pyogenes and S. flexneri, respectively. Colonies were counted from throat swabs and stool samples in S. pyogenes and S. flexneri models, respectively; in addition to their homogenized tissues. Opsonic and bactericidal activity and IgG levels were detected in mice’s serum followed by histopathological analysis. Immunized mice's sera showed a significant increase in both opsonic activity (TW80 produced BGC = 68% and TX100 produced BGC =75%) in S. pyogenes model. Immunized mice sera showed a significant increase in serum bactericidal activities (TW80= 56% & TX100=40%) in S. flexneri model compared to the positive control. IgG levels in BGC groups were significantly higher than negative control in both models by three and four folds in TW80 and TX100 vaccines, respectively. Histopathological analysis of S. pyogenes model revealed that the TW80 vaccine is safer and more efficient than the TX100 vaccine. While both versions of S. flexneri BGVs were safe in histopathological level. All versions of BGVs showed significant immune responses against their challenge infection in mice. However, additional pre-clinical studies are needed to confirm their effectiveness and safety.

الخلايا الشبحية البكتيرية (BGCs) هي خلايا بكتيرية تم إخلاؤها من المواد الوراثية والسيتوبلازمية. حيث أن تطبيقات استخدام BGCs متغيرة ويتم دراستها بشكل عملي في الوقت الحاضر. لقد ثبت أن استخدام الأشباح كلقاحات مرشحة، ومواد مساعدة، وآليات توصيل لقاحات الحمض النووي الريبي (RNA) أو الحمض النووي (DNA) فعال. يعتمد مفهوم إنشاء BGCs على تكوين أصداف فارغة عن طريق إحداث ثقوب وإخلاء محتوياتها الجينية والسيتوبلازمية بشكل كامل. يجب أن تحافظ خلايا BGC الناجحة كمرشحة للقاح على السلامة الهيكلية للخلية مع إنتاج استجابة مناعية فعالة وآمنة.
هدفت هذه الدراسة إلى إنتاج أربعة إصدارات من الخلايا الشبحية البكتيرية (BGCs) باستخدام الخلايا الشبحية إيجابية الجرام العقدية المقيحة (S. pyogenes) والخلايا الشبحية سلبية الجرام الشيجلا فلكسنيري (S. flexneri). ركزت الدراسة على إنتاج خلايا شبحية بكتيرية إيجابية الجرام باستخدام المعالجة الكيميائية من خلال تطبيق مادة خافضة للتوتر السطحي غير أيونية تسمىTween 80 (TW80). بالإضافة إلى ذلك، قدمت الدراسة تقنية موحدة جديدة لإنتاج BGCs باستخدام عامل معالجة كيميائي جديد يسمى Triton X-100 (TX100).
تم إجراء العديد من اختبارات فحص الجودة في المختبر لتقييم الإنتاج الناجح لهذه المستحضرات. على سبيل المثال، أظهرت جميع نسخ BGCs عدم وجود نمو في المزارع الصلبة والسائلة، مما يؤكد القتل الكامل وغياب الخلايا الحية داخل المستحضرات. ‎
أظهر الفحص المجهري لحبيبات BGCs المصبوغة بصبغة الجرام أن سلامة الخلايا بعد الإنتاج تم الحفاظ عليها.‏
علاوة على ذلك؛ يؤكد تصوير خلايا BGC باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح وجود أنفاق غشائية على سطح تحضير خلايا BGC مما يضمن نجاح إنتاج هذه الخلايا.
وأخيرًا، فإن الكمية الكبيرة من الحمض النووي والبروتينات المنطلقة من خلايا BGC تضمن الإنتاج الناجح مقارنةً بالخلايا الأصلية غير المعالجة.‏
في هذه الدراسة، تميل تلك الخلايا BGC إلى أن تكون لقاحًا مرشحًا ضد S. pyogenes وS. flexneri، لذلك كان من الضروري اختبار النشاط المناعي المحتمل.
تم اختبار المناعة من خلال تصميم تجربة التحصين والتحدي في الجسم الحي في الفئران. تم تصميم دراسة أولية لاختيار سلالة الفئران الأكثر حساسية تجاه S. pyogenes ATCC 19615 للتحدي داخل الأنف. أشارت تلك الدراسة إلى أن إناث الفئران NIH/Ola-Hsd بعمر الستة أسابيع في يوم التحدي كانت أكثر سلالات الفئران حساسية تجاه عدوى ATCC 19615 داخل الأنف.
تم إجراء التحصين داخل الأنف لـ S. pyogenes BGCs ثلاث مرات، يليه تحدي للأنف بخلايا حية من S. pyogenes ‏ATCC 19615 مرة واحدة. تم التحقق من سلامة كل من مستحضرات S. pyogenes BGC في الجسم الحي من خلال جمع عينات مسحات من الحلق بعد كل جرعة تحصين في اليوم الأول والثالث والسادس والتاسع بعد التحصين؛ والذي أشار إلى عدم وجود أي S. pyogenes حية في أي من مستحضرات BGC.
في نهاية دورة التحصين بدأت تجربة التحدي بعد اسبوعين من آخر جرعة تحصين. تمت مراقبة تقدم التحدي من خلال تجربة العد القابلة للتطبيق لعينات مسحة الحلق المجمعة بدءًا من اليوم الأول حتى اليوم التاسع بعد التحدي. كانت المجموعة الضابطة الإيجابية (غير المحصنة والمتحدىة بـ ATCC 19615) هي المجموعة الوحيدة التي أظهرت وجود CFU لـ S. pyogenes. لم تظهر أي من المجموعات المحصنة التي تحتوي على BGCs CFU لـ S. pyogenes بعد التحدي باستخدام ATCC 19615.
تم إجراء النموذج الفأري الآخر للتحقق من مناعة وسلامة S. flexneri BGCs باستخدام طريق الحقن من خلال الغشاء البيرتوني. كما أجريت الدراسة التجريبية الثانية لاختيار سلالة الفئران الأكثر حساسية تجاه العدوى داخل الصفاق S. flexneri ATCC12022. وقد اظهرت تلك الدراسة ان ذكور الفئران BALB/C بعمر الستة أسابيع في يوم التحدي أكثر سلالات الفئران حساسية للإصابة بالعدوى ATCC 1202 داخل الغشاء البيرتوني.
تم إجراء التحصين داخل الغشاء البيرتوني لـ S. flexneri BGCs ثلاث مرات، يليه تحدي داخل الغشاء البيرتوني بلقاح خبيث من flexneri S ATCC 12022 مرة واحدة. تم التحقق من سلامة كل من مستحضرات S. flexneri BGC في الجسم الحي من خلال جمع عينات البراز بعد كل جرعة تحصين عند 1، 3، 6، 12 و 24 ساعة بعد التحصين؛ والذي أظهر عدم وجود أي خلايا حية من S. flexneri في أي من تحضيرات BGC.
في نهاية تجربة التحصين والتحدي، تم الكشف عن الاستجابة المناعية العضدية (IgG) لجميع المجموعات المحصنة مع BGCs مقارنة بالمجموعات غير المحصنة والمجموعات غير المحصنة. وأظهرت المجموعات المحصنة ب BGCـ Triton X-100 وTween 80 زيادة بمقدار أربعة وثلاثة أضعاف بالمقارنة مع المجموعة المتحدية غير المحصنة (التحكم الإيجابي). ‎
أظهرت المجموعات المحصنة بـ BGCs زيادة ملحوطة في نشاط مبيد الجراثيم في المصل، (TW80=52% & TX100=63%) في نموذج S. pyogenes، (TW80= 56% & ‏TX100=40%) في نموذج S. flexneri مقارنة بـ التحكم الإيجابية.
أظهر التحليل النسيجي المرضي لأنسجة الرئة والقصبة الهوائية أن لقاح TW80 أكثر أماناً وكفاءة من لقاح TX100 في نموذج S. pyogenes، بينما كان كلا الإصدارين من S. flexneri BGCs آمنين على المستوى النسيجي. هناك حاجة لدراسات ما قبل السريرية إضافية لتأكيد الفعالية والسلامة المطلقة لـ BGCs.‏

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.