Thesis (M.Sc.) -Cairo University, 2023.

Bibliography: pages 104-130.

Depression represents a major health threat that is currently spreading at
alarming rates worldwide. Depression negatively affects quality of life,
productivity of patients, and it is a leading cause of suicidal death.
Different pharmacological and non-pharmacological therapies are currently
available. These approaches aim at improving disease symptoms, negative
thoughts, maladaptive behavior, and hopefully, the underlying pathological
mechanisms. Acknowledging the huge efforts already made, yet many patients
are rendered resistant or, at least, showing poor response. These challenges
created a mandatory need to search for newer pathological pathways and novel
therapies for the disorder.
The current study emphasizes the role of empagliflozin (Empa) in
neuroprotection and neural resilience potentiation in the reserpine (Res) animal
model of depression. Mastered by Adenosine monophosphate-activated protein
kinase (AMPK) activation, the Sodium–glucose cotransporter (SGLT2) inhibitor
is thought to fine regulate the triad of autophagy, inflammation, and oxidative
stress in the brain. Deeper evaluation revealed the ability of Empa to rebalance
the disturbed autophagy/inflammation dynamics through manipulation of the
autophagic machinery components: mechanistic target of rapamycin
(mTOR)/Beclin1/ microtubule-associated protein light chain 3 (LC3B) and
attenuation of the nod-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome cascade.
Consequently, reinforcement of hippocampal neurogenesis was demonstrated as
a valuable outcome of Empa treatment. This latter effect is thought to be mediated
partly through AMPK which orchestrates protein kinase C zeta (PKCζ)
phosphorylation and highlights an unusual role for nuclear factor kappa B (NFκB) in boosting brain derived neurotrophic factor (BDNF) production, an
outcome that necessitates NF-κB phosphorylation at Ser311 upon interaction with
PKCζ.
Summary and Conclusions
100
To fulfill the aim of this work, rats were injected with Res (0.2 mg/kg/day; i.p.)
for 14 days to induce depression-like behavior in rats. The male albino Wistar rats
were utilized and randomly allocated into four groups. All drugs were
administered for fourteen consecutive days. Animals in the first group received
normal physiological saline (1 mL/day; p.o.) and served as the negative control
(normal) group. Rats in groups 2–4 were exposed to reserpine (0.2 mg/kg/day;
i.p.). Specifically, those in group 2 were left untreated to serve as the positive
control group; animals in groups 3 and 4 were treated with escitalopram (Esc) (10
mg/kg/day; p.o.) and Empa (10 mg/kg/day; p.o.), respectively. Animals were
constantly monitored for food and water intake and were weighed at the end of
the study to assess body weight changes.
On the 15th day, rats were behaviorally tested using open field test (OFT), tail
suspension test (TST), and forced swimming test (FST). After performing
behavioral tests, rats were euthanized by decapitation under anesthesia using
phenobarbitone (40 mg/kg; i.p.). Hippocampi were isolated, washed, and dried.
For each group, two sets were conducted: one (n=3) for histopathological
examinations in addition to Beclin1 and LC3B immunoreactivity determination,
while the second (n = 10) was saved for biochemical investigations. The latter
involved measuring the hippocampal contents of monoamines, p-PKCζ (Thr403),
BDNF, glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA), inducible nitric oxide
synthase (iNOS), caspase-1, interleukin (IL)-1β, IL-18, and tumor necrosis
factor-alpha (TNF-α) using ELISA kits, in addition to determining p-AMPKα1
(Thr172), p-CREB (Ser133), mTOR, and p-NF-kB p65 (S311) protein expression
using western blot assay as well as NLRP3 gene expression using PCR. The
results of the current study can be summarized as follows:
Summary and Conclusions
101
A.Effects of the reserpine protocol on rats
1. Reserpine's exposure signified prominent impairment in weight gain parallel
to a decrease in food consumption.
2. A state of depressive behaviour was revealed by the decrease in ambulation
frequency rate in OFT, and prolonged immobility time in TST and FST.
3. Reserpine reduced hippocampal contents of the three classical monoamines:
serotonin (5-HT), dopamine (DA), and norepinephrine (NE), thus confirming
the progression of a depressive phenotype.
4. Importantly, hippocampal autophagic response markedly declined with
reserpine which disrupted the AMPK/mTOR/Beclin1/LC3B machinery, and
conversely, neuro-inflammation prevailed under the influence of the NLRP3
inflammasome pathway as manifested by remarkable upsurges in
hippocampal TNF-α, IL-1β, and IL-18 levels together with oxidative/nitrative
stress.
5. Consequently, AMPK-mediated neurotrophins secretion and neurogenesis
obviously deteriorated through PKCζ/NF-κB/BDNF/CREB signal restriction.
6. Microscopically, rats exposed to Res showed severe neuropathic alterations,
included severe neuronal degeneration with abundant records of
hyperesenophilic, pyknotic, and structureless pyramidal neurons that lack
distinct subcellular details, and few dispersed apparent intact cells. In
addition, severe perineuronal edema accompanied with obviously high
reactive glial cell infiltrates with congested blood vessels were observed.
B. Effects of Esc and Empa on rats exposed to Res
1. Both Esc and Empa significantly improved weight gain in an equivalent
manner.
2. In behavioral assessments, treatment with either Esc or Empa showed
equivalent efficacy in terms of decreasing the immobility periods in TST and
FST and restoring them to the normal values. Moreover, rats subjected to Esc
Summary and Conclusions
102
or Empa injections showed improved ambulation frequency in the OFT as
compared to the Res group.
3. Esc and Empa produced analogous results with significant increments in
hippocampal 5-HT, DA, and NE.
4. The Res-induced dysregulations in hippocampal autophagic machinery were
equally amended by Esc and Empa, except for Beclin1 which was more
impacted by Esc than by Empa. In this context, both Esc and Empa
significantly replenished the immunohistochemical expressions of Beclin1 and
LC3B. Meanwhile, they both reduced the protein expression of mTOR.
5. Both Esc and Empa produced analogous results as antioxidants, which was
reflected in the remarkable increment in hippocampal GSH and the mitigation
of MDA and iNOS levels as compared to the Res group.
6. Both Empa and Esc were equally efficient in terms of their ability to halt the
NLRP3 inflammasome overactivation, resulting in significant decrements in
the NLRP3/caspase-1/IL-1β/IL-18/TNF-α cascade versus the Res group.
7. Administration of Esc or Empa resulted in remarkable increments in the
hippocampal concentrations of p-PKCζ (Thr403) and BDNF, as well as the
protein expressions of p-NF-κB p65 (Ser311) and p-CREB, which play an
important role in enhancing neurogenesis and neuroplasticity.
Based on the results reported herein, conclusion can be constructed
as:
1. The Res protocol created a depressive phenotype in rats at the behavioral,
biochemical, and microscopic levels.
2. Under Res administration, the hippocampal neuro-inflammation outweighs the
autophagic response. Res-injected rats showed upregulation of NLRP3 gene
expression, with consequent increase in caspase-1, IL-1β/18, and TNF-α levels,
eventually resulting in neuro-inflammation, impaired neurogenesis, and
monoamine neurotransmission decline.
Summary and Conclusions
103
3. Our findings imply that Res administration created a sharp state of oxidative
stress in rats' hippocampi, which was revealed by the eminent decline in GSH
and the prompt increase in iNOS and MDA, lead to progression of depression.
4. Treatment with Empa led to enhancement of AMPK phosphorylation by
inhibiting the activation of mTOR.
5. Administration of Esc or Empa mitigated Res-induced reduction of
hippocampal immunoreactivity of the two autophagy-related proteins, Beclin1
and LC3B which are key agents of early and late autophagy. Meanwhile, they
both reduced the protein expression of mTOR to one-half its value as compared
to the Res group
6. Empa demonstrated promising antidepressant potentials, equivalent to Esc, by
reinforcing autophagy, mitigating the inflammatory process, and reducing
oxidative stress, in addition to potentiating hippocampal neurogenesis and
neuroplasticity. Clinical studies are needed in the future to clarify and verify the
implications of Empa for depressive patients.

يعد الاكتئاب أحد أكثر الاضطرابات النفسية العصبية انتشارًا والسبب الرئيسي للإعاقة في جميع أنحاء العالم. وهو المرض الثاني الذي يشكل أكبر تهديد اجتماعي واقتصادي للدول المعاصرة. على الرغم من أن البيانات المتعلقة بانتشار الاكتئاب في غالبية الدول ليست متاحة بسهولة، إلا أن المعلومات المتوفرة تظهر أن الحالة شائعة، حيث يعاني واحد من كل خمسة أشخاص من نوبة الاكتئاب في مرحلة ما من حياتهم.ويتسم هذا المرض بطبيعة معقدة ومتعددة العوامل؛ حيث لا يشمل فقط اضطراب المشاعر، بل أيضاً اضطرابات إدراكية ووظيفية، لذا يمكن القول بأن الاضطراب الاكتئابي يؤثر سلباً على جودة الحياة وإنتاجية المريض بدرجة كبيرة.في الواقع إن بعض الأمراض المتزامنة، وعلى رأسها داء السكري، تزيد من زيادة أعراض الاكتئاب وتجعل العلاج أكثر صعوبة. كما أشارت الدراسات إلى وجود علاقة متبادلة بين الاضطراب الاكتئابي وداء السكري، وذلك على الأرجح بسبب وجود آليات مرضية مشتركة بينهما والتي تسهم في تطور كلا المرضين.
على الرغم من التقدم الهائل في فهمنا الفسيولوجيا المرضية للاكتئاب، لا يوجد نموذج أو آلية واحدة كاملة بما يكفي لمراعاة جميع جوانب المرض. يعد عدم التوازن في النقل العصبي أحادي الأمين أحد الآليات الأساسية للاكتئاب، بالإضافة إلى انخفاض تكوين الخلايا العصبية في قرنآمون، والإجهاد التأكسدي المفرط، والالتهاب العصبي، وفقدان الخلايا العصبية وضمورها، وتحديدًا في القشرة الدماغية وقرن آمون.
ينتمي دواءإمباجليفلوزين للفئة المثبطة للناقل المشارك للصوديوم والجلوكوز-2، وتمثل هذه الأدوية طفرة في علاج داء السكري من النوع الثاني. ولا تزال الدراسات المستمرة تظهر التأثيرات الصحية الواعدة لهذه الفئة من الأدوية على أجهزة الجسم المتعددة، وتحديداً القلب والكلى. وفي الآونة الأخيرة زاد الاهتمام بدراسة الأثر الإيجابي لهذه الأدوية على المخ، حيث ثبت وجود هذا الناقل في عدة مناطق، مثل قرن آمون والخلايا البطانية لحاجز الدم في الدماغ. وعلاوةً على ذلك، أظهرت الدراسات قدرة هذه الأدوية على حماية الخلايا العصبية، وذلك لتأثيراتها المضادة للأكسدة والالتهاب وموت الخلايا المبرمج، بالإضافة إلى تحفيز تكوين الخلايا العصبية، وكل هذا بعيداً عن قدرتها على التحكم بمستوى السكر بالدم.






الهدف من العمل :
يهدف البحث الحالي إلى استكشاف إمكانات الحماية العصبيةلإمباجليفلوزين في نموذج الريزيربين للاكتئاب لدى الفئران. بالإضافة إلى ذلك، ركزت هذه الدراسة على تقييم دور الالتهام الذاتي لإمباجليفلوزينمن خلال تقييم تأثيره على مسار الأدينوزين أحادي فوسفات كيناز ألفا 1 وربط تأثيره على مسار الالتهاب "إن إل آر پي 3" ومسارات إشاراتبروتين كيناز سي، عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ والعاملالنوويكابابي.
المواد والطرق:

• الحيوانات
تم استخدام ذكور جرذان ويستار والتي تراوح وزنها ما بين 180 إلى 200 جرام. نفذت كافة الخطوات والعمليات التجريبية وفقاً لمعايير لجنة الأخلاقيات بكلية الصيدلة، جامعة القاهرة.
• الأدوية
- الريزيربين
- اسيتالوبرام
- أمباجليفلوزين
• إحداث الاضطراب الاكتئابي في الجرذان:
تم إحداث الاكتئاب بجرعة واحدة من الريزيربين(0.2 ملجم/كجم/يوم؛ داخل الصفاق)يوميًا لمدة 14 يومًا.
التصميم التجريبي:
تم تقسيم الحيوانات إلى أربع مجموعات يحتوي كل منها على 13 جرذ:
1. المجموعة الأولى:تم إعطائهاالمحلول الملحي وكانت بمثابة المجموعة (السلبية الضابطة).
2. المجموعة الثانية: تم فيها إعطاء الريزيربين بجرعة واحدة يومياً (0.2 ملجم/كجم/يوم؛ داخل الصفاق)لمدة 14 يوم ويمثل المجموعة الاكتئابية(الضابطة الإيجابية).
3. المجموعةالثالثة: أعطيت فيها الجرذان إسيتالوبرام بجرعة (10 ملجم/كجم/يوم؛ عن طريق الفم) لمدة 14 يومًا متتالية مع الريزيربين، حيث سبق إسيتالوبرامريزيربين بساعة واحدة. تجدر الإشارة إلى أن إسيتالوبرام كان بمثابة دواء قياسي مضاد للاكتئاب.
4. المجموعة الرابعة: عولجت تماماً مثل المجموعة الثالثة، باستثناء إسيتالوبرام الذي تم استبداله بدواء إمباجليفلوزين، دواء الاختبار، وتم إعطاؤه بجرعة تعادل (10 ملجم/كجم/يوم؛ عن طريق الفم).
استمر إعطاء الأدوية لمدة 14 يومًا، وفي اليوم الخامس عشر، خضعت الحيوانات لتقييمات سلوكية للتحقق من النمط الظاهري للاكتئاب. في نهاية المطاف، تم التضحية بالجرذان عن طريق قطع الرأس تحت التخدير باستخدام فينوباربيتون (40 ملجم / كجم؛ داخل الصفاق) وتم تجميد أجساد الحيوانات حتى حرقها، وذلك طبقاً للقواعد التي تحددها كلية الصيدلة جامعة القاهرة.
تم تقييم الآثار العلاجية للعقار المختبر بواسطة:
تجارب سلوكية:
- اختبار المجال المفتوح
- اختبار تعليق الذيل
- اختبار السباحة القسرية
قياس بعض المؤشرات البيوكيميائية في الحصين:
• قياس محتويات قرن آمون من الأمينات الأحادية، وكذلك قياس مستوى الإنترلوكينات 1بيتا/ 18 وعامل النخر الورمي ألفا، بالإضافة لقياس مستوى مضاد الأكسدة الجلوتاثيونومالونديالدهيد،وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ باستخدام مجموعة الإليزا، بالإضافة إلى تحديد الفعالية المناعية للبيكلين1، وال سي ثري بي، كما تم قياس التعبير البروتيني لبروتينات الالتهام الذاتي من خلال قياس إم توار، والأدينوزين أحادي فوسفات كيناز ألفا 1باستخدام لطخة ويسترن، وكذلك قياس التعبير الجيني ل "إن إل آر پي 3".
• تم فحض الأنسجة مجهرياً باستخدامشرائح مستقطعة مختارة من مخ الجرذان المستخدمة في هذه التجربة.
ويمكنإيجازنتائجهذهالدراسةفيمايلي:
أولاً:تأثير بروتوكول ريزربين على الجرذان:

أدى تعرض الجرذان لريزيربين بجرعة (0.2 ملجم/كجم/يوم؛ داخل الصفاق) لمدة 14 يوم إلى:
1. زيادة في إنخفاض الوزن كما تسبب بإحداث نمط اكتئابي متمثلاً في تغيرات سلوكية ظهرت بشكل واضح في اختبارات الحقل المفتوح وتعليق الذيل والسباحة القسرية.
2. أدى إعطاء ريزيربين الي إحداث نقص ملحوظ في محتوى قرن آمون من الناقلات العصبية أحادية الأمين: السيروتونين، الدوبامين، والنورإبنفرين.
3. على المستوى الكيميائي الحيوي، تشير النتائج الحالية إلى أن التهاب العصب في قرن آمون يفوق عملية الالتهام الذاتي في الجرذان المعرضة لريزيربين.
4. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن حقنريزيربين خلق حالة حادة من الإجهاد التأكسدي في قرن آمون الجرذان، وهو ما تم الكشف عنه من خلال الانخفاض الملحوظ في الجلوتاثيون والزيادة السريعة في المالونديالدهيدو الانزيم المصنع لاكسيد النتريك المستحث.
5. كمازاد نشاط مسار الجسيم الالتهابي "إن إل آر پي 3" بكل عناصره،مما أدى بدوره إلى إحداث حالة من الالتهاب في الخلايا العصبية.
6. أظهرت الجرذانالمحقونهبريزيربينتغييرات في منظمات الالتهام الذاتي في قرن آمون ،وقد لوحظت اختلالات ملحوظة في آلية الالتهام الذاتي في قرن آمون من خلال ريزيربين، حيث انخفض بيكلين1 وزاد إم توار مقارنةً بالمجموعة الضابطة.
ثانياً: تأثير العلاجات المختبرة على الجرذان المصابة بالاضطراب الاكتئابي:
1. ساهم كل من إمباجليفلوزينوإيسيتالوبرام في تحسن اكتساب الوزن عند الجرذان.
2. تمكنت الأنظمة العلاجية المستخدمة من تعديل السلوك الاكتئابي في الجرذان، من خلال زيادة تردد التمشي في اختبار المجال المفتوح، وتقليص فترة اللاحركةفي اختبار تعليق الذيل، والسباحة القسرية.
3. تحسنت بشكل واضح مستويات الناقلات العصبية أحادية الأمين (السيروتونين، الدوبامين، والنورإبنفرين) إلى حد يقارب القيم الطبيعية تحت تأثير كل من العلاجين، حيث لم يتفوق أحد منهما على الآخر.
- في هذا السياق، قام كل من إسيتالوبرامأمباجليفلوزين بتجديد التعبيرات الكيميائية المناعية لـلبكلين1 وال سي 3 بي بشكل كبير. وفي الوقت نفسه، قام كلاهما بتخفيض التعبير البروتيني لـ إم توار إلى نصف قيمته مقارنة بمجموعة الريزيربين.
4. بذل كل من إسيتالوبراموإمباجليفلوزين إمكانات رائعة كمضاد للأكسدة، وهو ما انعكس في الزيادة الملحوظة في الجلوتاثيونفي قرن آمون وتخفيف مستوى مالونديالدهيد، مقارنة بمجموعة الريزيربين.
5. إلى جانب ذلك، أثبت كل من إسيتالوبراموإمباجليفلوزين جدارته في السيطرة على حالة الالتهاب العام وذلك من خلال تثبيط مستويات الإنترلوكينات 18/ 1 بيتا في الحصين.
6. أسفر استخدام كل من العلاجين الى تنشيط البروتينات المسؤولة عن تنشيط نمو الخلايا العصبية والذي انعكس في الزيادة الملحوظة في كل من الأدينوزين أحادي فوسفات كيناز ألفا 1، بروتين كيناز سي، وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.