TY  - BOOK
AU  - Neveen Mahmoud Mohamed El-Metwally
AU  - Yasser El-Mohammady Ragab
TI  - Production of Polyhydroxybutyrate by Locally Isolated Bacterial Strain, Cloning and Expression of the Corresponding Genes into Escherichia coli
U1  - 615.1 
PY  - 2022///
KW  - pharmacy
KW  - Polyhydroybutyrate
N1  - Thesis (Ph.D)-Cairo Univsersity,2022; 107-126:Includes bibliogriphical references
N2  - تم اختبار 38 عزلة بكتيرية مختلفة، تم عزلها من ستة عينات مختلفة من التربة نشأت من مدن مصرية مختلفة لإنتاج البولى هيدروكسى الكانوات، من بين العزلات المختبرة، أظهرت العزلة البكتيرية 6N-NRC أعلى إنتاج للـبولى هيدروكسى الكانوات (38.63%) تم تحليل البولى هيدروكسى الكانوات المستخرج باستخدام تقنيات الرنين المغناطيسى النووي التي أظهرت أنه من النوع البولي هيدروكسي بيوترات (PHB). ثم بعد ذلك إخضاع العزلة البكتيرية المختارة (6N-NRC) للتعريف المورفولوجي، الكيميائي الحيوي والجزيئي. كشف تحليل BLAST لتسلسل الجين 16SrRNA المتضخم عن درجة من التشابه بنسبة 99% مع جين 16SrRNA الجزيئي لسلالة باسيلس أريابهاتاى B8W22 (رقم الانضمام NR_115953.1). ثم تقديم تسلسل جين 16SrRNA إلى بنك الجينات NCBI مع قاعدة بيانات تسلسل النيوكليوتيدات تحت رقم الانضمام MH997667.1. • أجريت تجارب القوارير المهتزة حيث تم تحسين الوسط الغذائي وعوامل النمو باستخدام عامل واحد فقط فى كل مرة فى تجربة الوقت بناء على ذلك، تمت زارعة العزلة المختارة باسيلس أريابهاتاى MH997667.1 فى وسطي تخمير مختلفين بجانب وسط المسح (MSM). تم الحصول على أعلى إنتاج للـبولي هيدروكسي بيوترات بواسطة وسط الفرز (MSM) بنسبة (38.63%) ، ثم فحص وقت الحضانة ومكونات الوسط الغذائي المختلفة (مصدر الكربون ومصدر النيتروجين) وحجم اللقاح من أجل تحسين الوسط الغذائي (MSM) للحصول علي أفضل إنتاج للبولي هيدروكسي بيوترات بواسطة باسيلس أريابهاتاى MH997667.1.  • لقد لوحظ أن إضافة مولاس البنجر (20جم /لتر) كمصدر وحيد للكربون وحيد هو الأفضل لإنتاج البولى هيدروكسى بيوترات بعد فترة حضانة لمدة يومين مع استخدام 0.75جم/ لتر من كلوريد الأمونيوم كمصدر للنيتروجين والذى أدي إلى أعلى انتاجية من البولى هيدروكسى بيوترات (2.3جم/لتر) مع حجم القاح 3% (حجم/حجم) عند درجة أس هيدروجيني ابتدائية 7.5 مع 3.525، 1.5، 0.2، 0.2جم/لتر من ثنائي هيدرات فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم، بوتاسيوم هيدروجين فوسفات، كبريتات المغنسيوم، كلوريد الكالسيوم على التوالي عند درجة حرارة حضانة 30 oوسرعة اهتزاز قدرها 200 دورة فى الدقيقة.  • تم عمل دراسة نموذج احصائي على مرحلتين. تمت المرحلة الأولى باستخدام تصميم Plackett-Burman لتقييم تأثير ظروف الاستزراع على إنتاج الـبولي هيدروكسي بيوترات. وطبقا لنتائج هذا التصميم تبين أن أكثرهم تأثيرا هم تركيز مولاس البنجر، درجة الحموضة ومدة التحضين.  • المرحلة الثانية تمت عن طريق تطبيق تصميم (Box-Behnken) لدراسة تركيز وتأثير تداخل المكونات الأكثر تأثيرا على انتاج الـبولي هيدروكسي بيوترات نتج عنه الوصول إلى زيادة الانتاج بمقدار 1.6 مرة (3.799جم/لتر) مقارنة بالوسط الأساسى (2.3جم/لتر). أظهر تحليل سطح الاستجابة لتجربة التحسين الثانية أن تركيز مولاس البنجر 30جم/لتر وقيمة الأس الهيدروجيني 8 ومدة التحصين 36 ساعة كانت ظروف الإنتاج المثلي. تم الاحتفاظ بالمتغيرات الأخرى فى قيمها الأولية.  • من أجل إنتاج الـبولي هيدروكسي بيوترات على نطاق واسع ، تم استخدام مخمر معملى سعة 5 لتر، باستخدام الوسط الغذائى الأمثل الذى تم تحديده فى تجارب القوارير المهتزة المشار اليها سابقا. بتجربة ثلاثة مستويات من سرعة التحضين المهتز(200 ، 250 و 300 دورة في الدقيقة) ؛ وجد أن سرعة التحريك المثلى هي 250 دورة في الدقيقة. تم الحصول على أعلى إنتاجية من الـبولي هيدروكسي بيوترات (2.3 جم/لتر) بعد مرور 24 ساعة من فترة التخمير. لم يتأثر الأس الهيدروجيني خلال فترة التخمير باستخدام سرعات تقليب مختلفة. تم عمل نمذجة رياضية باستخدام المعادلة اللوجستية ومعادلة Luedeking-Piret لوصف نمو الكتلة الحيوية وإنتاج الـبولي هيدروكسي بيوترات بدقة. تم إستخدام برنامج MATLAB 2019 لمحاكاة العملية التجريبية ، أظهرت البيانات المحاكاة توافقًا جيدًا مع النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها خلال أول 24 ساعة من فترة التخمير باستخدام سرعة تقليب 250 دورة في الدقيقة. • جرت محاولة لعزل الجينات المسؤولة عن إنتاج الـبولي هيدروكسي بيوترات مثل  (phbB) acetoacety-CoA reductase و (phbC) polyhdroxybutyrate synthase ، واستنساخ هذه الجينات والتعبير عنها من سلالة باسيلس أريابهاتاى MH997667.1 المعزولة محليا إلى سلالة الإيشيريشيا كولاى المضيف النموذج للتعبير الجيني غير المتجانس. تم بنجاح عزل جينات phbB، phbC واستنساخها وتم تحديد PCR amplicon 744، 1089 bp المقابلة لجينات phbB، phbC واستنساخها باستخدام بلازميدpET-29a(+) ، وتحويلها والتعبير عنها فى الإيشيريشيا  كولاى BL21.  • قد أوضحت النتائج أن تسلسل phbB متطابق بنسبة 99.06% مع تسلسل reductase acetoacetyl-CoA لسلالة باسيلس أريابهاتاى CP024035.1 بينما وجد أن تسلسل phbC متطابق بنسبة 87.18% لتسلسل polydroxybutyrate-synthase لسلالة باسيلس أريابهاتاى CP024035.1 بعد تسلسل الحمض النووي. أوضح تحليل البروتينات المؤتلفة من الإيشيريشيا كولاى BL21 المؤتلفة بواسطة polyacrylamide gel electrophoresis tricine أن جينات phbC, phbB المعبر عنها فى سلالة الإيشيريشيا كولاى BL21 أظهرت نطاقات مميزة من الوزن الجزيئى 26.3 و 37.5 KD على التوالي. المستخلص  إن البولي هيدروكسى بيوترات (PHB) عبارة عن بوليستر قابل للتحلل الحيوي وله امكانيات كبديل واعد للبلاستيك المشتق من البتروكيماويات. فى هذه الدراسة تم فحص 38 عزلة بكتيرية من أجل إنتاج البولى هيدروكسى الكانوات حيث وجد أن 15 عزلة إيجابية لإنتاج البولى هيدروكسى الكانوات. تم العثور على العزلة البكتيرية 6N-NRC لتكون أكثرهم إنتاجية للـبولى هيدروكسى الكانوات.; ثم تحليل البولى هيدروكسى الكانوات المستخرج باستخدام تقنيات الرنين المغناطيسى النووي التي أظهرت أنه ينتمى إلى البولي هيدروكسي بيوترات. تعرضت العزلة البكتيرية المختارة (6N-NRC) للتوصيف الجزيئي الذي اظهر بوضوح أنها سلالة باسيلس أريابهاتاى و قد تم تقديمها إلى بنك الجينات NCBI مع قاعدة بيانات تسلسل النيوكليوتيدات تحت رقم الانصمام MH997667.1. إن تحسين عمليات التخمير والسلالات التي تسمح بإنتاج البولي هيدروكسى بيوترات من مصدر كربوني غير مكلف مطلوب للتنافس مع البدائل الاصطناعية وتقليد خصائصها المرغوبة. أجريت تجارب الدورق المهتز حيث تم تحسين الوسط الغذائي وظروف النمو باستخدام عامل واحد فى كل مرة وتصميم تجريبي متعدد العواملPlackett-Burman و Box-Behnken. تم استخدام نفايات مولاس البنجر كمادة وسيطة لإنتاج البوليمر الحيوي، بناء على تطوير تقنيات مختلفة لجعل هذه العناصر الغذائية متاحة بيولوجيا لبكتيرية باسيلس أريابهاتاى MH997667.1 لإنتاج البولي هيدروكسي بيوترات. تم التوصل إلى أن مولاس البنجر (30جم/لتر) كمصدر للكربون وكلوريد الأمونيوم (0.75جم/لتر) كمصدر للنيتروجين هما أفضل المصادر الغذائية للوصول لأقصى إنتاج للـبولي هيدروكسي بيوترات. وجد أن مدة التحضين 36ساعة ، ودرجة الحموضة للوسط8.0 ودرجة حرارة 30 °هم الظروف المثلى للحصول على أقصى عائد للـبولي هيدروكسي بيوترات يبلغ 3.799جم/ لتر. تم إجراء تجارب المخمر المعملي باستخدام مخمر بسعة 5 لتر من أجل التحكم في معاملات العملية الانتاجية. وجد أن سرعة التحريك المثلى هي 250 دورة في الدقيقة. تم الحصول على أعلى إنتاجية من البولى هيدروكسى بيوترات (2.3 جم / لتر) في فترة التخمير 24 ساعة. تم استخدام المعادلة اللوجستية ومعادلة Luedeking-Piret لوصف نمو الكتلة الحيوية وإنتاج البولي هيدروكسي بيوترات بدقة. تم استخدام برنامج MATLAB 2019 لمحاكاة العملية التجريبية وأظهرت بيانات المحاكاة توافقًا جيدًا مع النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها خلال أول 24 ساعة من إنتاج البولي هيدروكسي بيوترات باستخدام سرعة تقليب 250 دورة  في الدقيقة. يهدف العمل الحالي أيضا إلى دراسة الجينات المسؤولة عن إنتاج البولي هيدروكسي بيوترات مثل  acetoacety-CoA reductase phbB و phbC polyhydroxybutyrate synthase. تم تصميم مواد أولية مناسبة لعزل و نسخ الجينات(phbB)، (phbC). تم بنجاح عزل جينات phbB، phbC واستنساخها وتم تحديد PCR amplicon 1089,744 bp المقابلة لجينات , phbB phbC. تم التحول البكتيرى للإيشيريشيا كولاى Bl21. تم إجراء تضخيم جينات phbB، phbC باستخدام بادئات محددة لبلازميد (+)pET-29a. قد اوضحت النتائج أن تسلسل phbB متطابقاً بنسبة 99.06% مع تسلسل acetoacety-CoA reductase لسلالة باسيلس أريابهاتاى CP024035.1، بينما وجد أن تسلسل phbC متطابق بنسبة 87.18% لتسلسل polyhydroxybutyrate synthase لسلالة باسيلس أريابهاتاى CP024035.1 بعد تسلسل الحمض النووي. أوضح تحليل البروتينات المؤتلفة من الإيشيريشيا كولاى BL21 المؤتلفة بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام tricine-polyacrylamide أن جينات phbB وphbC المعبر عنها فى سلالة الإيشيريشيا كولاىBL21 أظهرت نطاقات مميزة من الوزن الجزيئى37.5 KD و 26.3 KDعلى التوالي
ER  -