Study the effect of antioxidant supplementation on developmental competence of vitrified dromedary camels (camelus dromedaries) oocytes on morphological and molecular aspects /
دراسة تأثير المكملات المضادة للأكسدة على الكفاءة التنموية للبويضات في الإبل على الجوانب المورفولوجية والجزيئية(Camelus Apredaries)
by Fatma Badawy Aboelwafa ; Supervision Committee Dr. Abd-El Kader Youssef Gamal El Din, Dr. Omaima Mohamed Kandil, Dr. Nasser Ghanem Osman.
- 83 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (M.Sc.)-Cairo University, 2023.
Bibliography: pages 58-83.
The purpose of the current study was to present the effect of ascorbic acid on the in vitro developmental competence of fresh camel oocytes, viability and developmental competence of the vitrified/thawed matured camel oocytes, mitochondrial distribution and intensity of the fresh and vitrified/thawed matured camel oocytes and gene expression profile of candidate genes regulating oocytes quality and development. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were recovered from camel ovaries collected from local abattoir. Excellent and good quality oocytes were in vitro matured in the TCM-199 maturation medium without any additives considered as fresh control group (FC) or with 50 μg/ml ascorbic acid defined as fresh ascorbic acid group (FAA) and both groups were incubated in CO2 incubator for 40 hours. Detecting the matured camel oocytes by the extrusion of 1st polar body (pb) in the FC and FAA. Some of fresh matured oocytes were fertilized with epididymal spermatozoa and checked for the fertilization rate. Other matured oocytes were vitrified by using ethylene glycol (EG) 20% and dimethyl sulfoxide (DMSO) 20%, the morphological changes were noticed after thawing and some of the vitrified/thawed control (VC) and vitrified/thawed ascorbic acid (VAA) oocytes were in vitro fertilized as described above. Some representatives of the matured camel oocytes from FC, FAA, VC and VAA were stained using Mito tracker red followed by Hoechst stain. The relative abundance of ATP5A1, SOD1, GDF9 and BMP15 among the FC, FAA, VC and VAA were assessed using real-time PCR. The obtained results showed that maturation rate of the FAA group was (80.77%; P˂0.001) higher than the FC ones (71.43%) and this reflecting on the fertilization rate which showed significant increase in the FAA group compared to the FC group (70.19% vs., 49.33%, respectively). The percentage of normal morphology of VAA was higher than VC (75% vs., 62.5%, respectively), the percentage of extrusion of 2nd pb in the VAA group (45.33%) was highly significant than VC ones (33%). The morphological abnormalities were higher in VC group (37.5%) than VAA group (25%) and the noticed morphological abnormalities were cytoplasm shrieked and fragmented, leakage of cellular content and zone breakage. The mean value of mitochondria intensity of the FAA (132) and VAA group (97.60) were significantly higher than FC (99.20) and VC group (85.6). The mitochondrial distributions were diffused, semi diffused and peripheral. The expression pattern of Cu-Zn Superoxide dismutase (SOD1), ATP synthase F1 subunit alpha (ATP5A1) and Growth and differentiation factor 9 (GDF9) genes were upregulated in the FAA group compared to the FC group. SOD1 and ATP5A1 were more abundant in the VAA group than in the VC group. Expression of bone morphogenetic protein 15(BMP15) showed non-significant differences among FAA and VAA groups. The VC and VAA groups expressed lower levels of ATP5A1, SOD1, GDF9 and BMP15 than the FC and FAA groups. In conclusion, supplementation of the maturation medium with ascorbic acid increased the maturation and fertilization rates, the recovery rate of vitrified/thawed dromedary camel oocytes with normal morphology and viability, mitochondrial intensity and distribution and gene expression profile in camel oocytes. تهدف الدراسة الحالية الي تقييم تأثير حمض الأسكوربيك على القدرة الإخصابية وتطورها لبويضات الإبل في الظروف المعملية وحيوية البويضات المجمدة /المسالة من الإبل وقدرتها على الإخصاب وكذلك كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها في بويضات الإبل الناضجة والمجمدة/المسالة والتعبير الجيني عن الجينات المختارة التي تعبر عن جودة البويضات وتطورها. تم الحصول على البويضات من مبايض الإبل التي تم جمعها من المجزر المحلي بعد ذبحها ثم استزراع مجموعة من البويضات (ذات النوعية الممتازة و الجیدة) باستخدام بيئة (TCM-199) في الظروف المعملية بدون أي إضافات تعمل كمجموعة ضابطة (FC) أو معاملة ب 50 ميكروجرام من حمض الأسكوربيك كمجموعة معالجة (FAA) وتحضنيهما لمدة 40 ساعة. تم الكشف عن بويضات الإبل الناضجة ذات الجسم القطبي الأول في كلا المجموعتينFC، FAAثم تخصيب جزء منها باستخدام الحيوانات المنوية من البربخ والكشف عن معدل الإخصاب. تم تجميد البويضات الناضجة FC، FAA بواسطة مزيج من DMSO+EG ولوحظ التغير المروفولوجي بعد إسالتهم، ثم اخذ مجموعه من البويضات الناضجة الضابطة المجمدة /المسالة (VC) والبويضات الناضجة المعاملة بحمض الأسكوربيك المجمدة /المسالة (VAA) وتخصبيها كما ذكر من قبل. صبغت البويضات الطازجة الناضجة (FC) والبويضات الطازجة المعاملة بـ 50ميكروجرام من حمض الأسكوربيك (FAA) والبويضات الناضجة المجمدة /المسالة (VC) والبويضات الناضجة المجمدة /المسالة المعاملة بـ 50 ميكروجرام من حمض الأسكوربيك (VAA) باستخدام صبغةMitotraker red ثم صبغة Hoechst. ولقد تم التحليل الجيني BMP15، GDF9، SOD1، ATP5A1 باستخدامReal Time PCR. أظهرت النتائج أن معدل بويضات الإبل التي نضجت بمعاملتها ب 50 ميكروجرام حمض الأسكوربيك كانت أعلى (80.77%) من المجموعة الضابطة (70.43%) وقد انعكس هذا على معدل الإخصاب والذي بلغ 70.19٪ مقابل 49.33٪ على التوالي. نسبة البويضات ذات الشكل المورفولوجي الطبيعي بعد الإسالة كانت اعلى في المجموعة المعاملة بحمض الأسكوربيكVAA بالمقارنة الي المجموعة الضابطة VC (75٪ مقابل 62.5٪ على التوالي). النسبة المئوية لخروج الجسم القطبي الثاني من بويضات الإبل الناضجة المجمدة /المسالة المعاملة ب 50 ميكروجرام حمض الأسكوربيكVAA (45.25%) مقارنة بمجموعة الضابطةVC (32.17%). كانت التشوهات المورفولوجية في مجموعة البويضات الضابطة الناضجة المجمدة/المسالة VC (37.5٪) أعلى من المعاملة بحمض الأسكوربيك VAA (25٪) مثل انكماش السيتوبلازم وتقلصه، تسرب المحتوى الخلوي. أظهرت النتائج ان كثافة الميتوكوندريا للبويضات المعاملة بحمض الأسكوربيك سواء كانت ناضجة طازجةFAA (132) أو مجمدة /مسالةVAA (97.60) كانت أعلى بكثير من المجموعات الضابطة سواء ناضجة طازجةFAA (99.20) أو مجمدة /مسالةVC (85.6) ووزعت الميتوكوندريا داخل البويضات منتشرة، شبه منتشرة وجانبية. وقد سجل ارتفاع التعبير الجيني عن جيناتSOD1 ATP5A1, GDF9, في المجموعات الناضجة المعاملة بحمض الأسكوربيكFAA,VAA حيث كانت أكثر من المجموعات الضابطةFC,VC. كان التعبير الجيني SOD1 وATP5A1 اعلى معنويا في البويضات المجمدة / المسالة المعاملة بحمض الأسكوربيك VAAعن المجموعات الضابطة VC. لا يوجد فروق معنوية في التعبير الجيني BMB15 في المجموعات المعاملة بحمض الأسكوربيك سواء كانت ناضجة طازجةFAA أو مجمدة / مسالةVAA. على كل حال أظهرت المجموعاتVC,VAA مستوى تعبير جيني اقل فيSOD1, ATP5A1, GDF9 بمقارنتها بمجموعتي FC, FAA . في الختام، فإن معاملة بيئة الإنضاج بحمض الأسكوربيك يزيد من معدل الإنضاج والإخصاب والعدد الطبيعي والحيوية للبويضات الإبل المجمدة وتخصبيها بعد الاسالة وكثافة الميتوكوندريا وتوزيعها والتعبير الجيني في بويضات الإبل