Genetical and Biotechnological Studies on Microtuberization of Potato (Solanum tuberosum L)/
دراسات وراثية وبيوتكنولوجية على درينات البطاطس (سولانم تيوبيرووزوم)/
Walaa Mohamed Reda Mohamed Adly ; Supervisors: Prof. Dr. El-Sayed Tarek Abd El-Salam, Dr. Ahmed Sayed Fouad, Prof. Dr. Mahasen Abd El Hakim Mohamed, Dr. Mohammed Eraky Eldenary.
- 59 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (Ph.D)-Cairo University, 2023.
Bibliography: pages 56-59.
Potato (Solanum tuberosum) is the most fundamental nongraminaceous food crop worldwide. Starch content is one of the major quality criteria targeted by potato breeding programs. It is a mixture of two polysaccharides named amylose and amylopectin. Conventional potato breeding is a difficult task due to the tetraploid nature and high heterozygosity of the potato genomes. In addition, searching for functional genetic variability in wild relatives is laborious and time-consuming. Somaclonal variations are the genetic variations arise during in vitro conditions. These variations are commonly observed among callus-sourced plants and can add to the pool of genetic variation essential for breeding. Nevertheless, the molecular mechanisms underlying somaclonal variation require further elucidation. Simple sequence repeats (SSRs) are potent molecular markers able to characterize genetic variations. Unfortunately, developing SSR markers requires prior knowledge of the targeted genome. SSR markers were used successfully to highlight variation in starch accumulation in several species. The transferability of SSR markers between species may be exploited in de novo SSR primer selection to highlight variation in starch accumulation in potato. Through three successive papers, the present thesis aimed to exploit somaclonal variation to select potato clones with distinguished starch accumulation potentials. To broaden the base of selection, the first paper aimed to enhance shoot regeneration in potato by promoting polyamines biosynthesis by adding AgNO3 to the shoot regeneration medium (MS medium supplemented with 30 gl-1 sucrose, 100 mgl-1 myoinositol and 2.25 mgl-1 BA). In addition to control, five concentrations of AgNO3 (2, 4, 6, 8, and 10 mgl-1) were used. In addition to monitor the impact of AgNO3 on regeneration, polyamines content, DNA damage as well as lipid peroxidation were measured. The effect of AgNO3 on regeneration assumed a more or less concentration-dependent bell-shaped curve peaked at 4 mgl-1. The stimulatory effect of AgNO3 on shoot regeneration was accompanied with increase in polyamines content without significant increase in DNA damage or lipid peroxidation. On the other hand, the inhibitory concentrations of AgNO3 on shoot regeneration were accompanied with increase in DNA damage, lipid peroxidation and polyamines accumulation. 52 SUMMARY &CONCLUISON The uncoupling of shoot regeneration and polyamines content recorded at high AgNO3 concentrations can be attributed to the consumption of polyamines to counteract the synchronized oxidative stress manifested by increases in H2O2 content, lipid peroxidation, and DNA damage. Among 105 callus-sourced clones, the second paper highlighted the higher tuberization potential of the somaclonal variant Ros 119, compared with the parent cv Lady Rosetta in a field experiment based on the weight and starch content of tubers. Although this somaclone was similar to the parent cultivar in the number of tubers produced, it exhibited tubers with 42 and 61% higher fresh and dry weights, respectively. Additionally, this clone recorded 10 and 75% increases in starch content based on the dry weight and average content per plant, respectively. The enhanced starch accumulation was associated with the upregulation of six starch-synthesisrelated genes, namely, the AGPase, GBSS I, SBE I, SBE II, SS II and SS III genes. AGPase affords the glycosyl moieties required for the synthesis of amylose and amylopectin. GBSS is required for amylose elongation, while SBE I, SBE II, SS II and SS III are responsible for amylopectin. The third paper aimed to establish functional SSR markers corresponding to variations in starch accumulation in potato somaclones. In addition to the original cultivar Lady Rosetta, fourteen callus-sourced somaclones were investigated for their starch and sugar contents as well as dry matter content. Of the selected somaclones, one represented clones with the same starch content of the original cultivar and another represented those of lower starch content. The remaining somaclones have higher starch content, compared with original cultivar. The combined results of two growing seasons unveiled significant positive correlation between dry matter content and starch content which was absent when replacing starch with soluble sugars. Insignificant correlations were recorded between sugar content and starch content. Based on the transferability of SSR markers between species, six SSR primers characterizing variation in starch accumulation in sweet potatoes were exploited to assess genetic diversity among the selected potato clones. The analysis generated distinct and reproducible banding patterns with 68 bands, of which 62 were polymorphic. 53 SUMMARY &CONCLUISON The utilized primers reflected high resolving power appeared in PIC of 0.457 in average and amplification of 44 unique bands, distributed in all studied clones except one of those containing higher starch content, compared with the original cultivar. This fingerprint is a prerequisite for recruiting clones with distinguished starch accumulation potential, addressed in the present study, in breeding programs targeting the improvement of starch accumulation in potato tubers. On the other hand, the utilized primers failed to establish phylogenetic relationship corresponding to starch content of the addressed clones. This may be attributed to utilization of few primers that did not cover a considerable proportion of the addressed genome. Conclusion: In conclusion, somaclonal variation is an inexhaustible source of genetic variations which is crucial for plant breeding programs. Through alterations in the expression profile of starch synthesis-related genes, somaclonal variation can enhance starch accumulation in potato tubers. The aforementioned alterations can be characterized using molecular markers including SSR that facilitates the future recruiting of somaclones with distinguished starch accumulation potential in breeding programs targeting the improvement of starch accumulation in potato tubers. البطاطس (سولا نيوم تيوبير سوم) هي المحصول الغذائي الأساسي (خارج محاصيل الحبوب) في جميع أنحاء العالم. ويعد محتوى النشا أحد أهم معايير الجودة الرئيسية التي تستهدفها برامج تربية البطاطس، وهو عبارة عن خليط من اثنين من السكريات العديدة تسمى الأميلوز والأميلوبكتين. تعد تربية البطاطس بالطرق التقليدية مهمة صعبة لانها رباعية الصبغيات وذات جينوم عالي في عدم التماثل الزيجوتي، بالإضافة إلى ذلك، فإن البحث عمليا عن التباين الوراثي في الأصول البرية أمر شاق ويستغرق وقتا طويلا. الاختلافات الجسمية هي الاختلافات الوراثية التي تنشأ أثناء الظروف المختبرية. وهذه الاختلافات تلاحظ بشكل شائع بين النباتات الناتجة من الكالس والتي يمكن أن تضيف إلى مجموعة التنوع الوراثي الضرورية لبرامج التربية. ومع ذلك، فإن آلية التغير الجزيئي المسببة للتباين الجسمي تتطلب مزيدًا من التوضيح. تكرارات التسلسل البسيط (SSRs) هي علامات جزيئية قوية قادرة على وصف الاختلافات الجينية. لسوء الحظ، يتطلب تطوير علامات SSR معرفة مسبقة بالجينوم المستهدف. تم استخدام علامات SSR بنجاح لتسليط الضوء على التباين في تراكم النشا في العديد من الأنواع. يمكن استغلال قابلية نقل علامات SSR بين الأنواع والتي ربما تستغل لاختيار بادئات SSR جديدة لتسليط الضوء على التباين في تراكم النشا في البطاطس. من خلال ثلاث أبحاث متتالية، تهدف هذه الرسالة إلى استغلال التباين الجسمي لاختيار سلالات خضرية من البطاطس ذات قدرة على تراكم النشا بشكل مميز. لتوسيع قاعدة الاختيار، يهدف البحث الاول إلى تحسين تجديد السيقان من كالس البطاطس من خلال تحفيز التخليق الحيوي للبولي أمينات عن طريق إضافة AgNO3 إلى وسط (بيئة) تجديد السيقان (بيئة موراشيج وسكوك مضاف له 30 ملجم/ لتر سكروز، و100 ملجم / لتر ميوينوسيتول و2.25 ملجم / لتر بنزايل أدينين). بالإضافة إلى معاملة الكنترول، تم استخدام خمسة تراكيز من AgNO3 (2، 4، 6، 8، و10 ملج/ لتر). بالإضافة إلى قياس تأثير AgNO3 على تجديد السيقان ، محتوى البولي أمينات وتلف الحمض النووي وكذلك قياس ليبيدات البيروكسيد. تم توضيح تأثير AgNO3 على التجديد بمنحنى على شكل جرس يعتمد على التركيز بشكل أو بآخر والذي يبلغ ذروته عند 4 ملجم/لتر. كان التأثير التحفيزي لـ AgNO3 على تجديد السيقان مصحوبًا بزيادة في محتوى البولي أمينات دون زيادة كبيرة في تلف الحمض النووي أو ليبيدات البيروكسيد. من ناحية أخرى، رافقت التركيزات المثبطة لـ AgNO3 على تجديد النمو الخضري زيادة في تلف الحمض النووي وليبيدات البيروكسيد وتراكم البولي أمينات. فقد سجل عدم الارتباط بين تجديد السيقان ومحتوى البولي أمينات عند استخدام التركيزات العالية من AgNO3والذي يمكن أن يعزى إلى استهلاك البولي أمينات لمواجهة الإجهاد التأكسدي المتزامن الذي يتضح في الزيادات في محتوى H2O2 وليبيدات البيروكسيد وتلف الحمض النووي. في تجربة حقلية، من بين 105 سلالة خضرية ناتجة من الكالس، سلط البحث الثاني الضوء على القدرة العالية على تكوين الدرنات في السلالة الخضرية Ros 119، مقارنة بالصنف الأصلي Lady Rosettaاعتمادا على الوزن ومحتوى النشا في الدرنات. على الرغم من أن هذه السلالة الخضرية كانت متشابهة مع الصنف الأصلي في عدد الدرنات المنتجة / نبات، 1 الملخصالعربى و الخاتمة
إلا أنه أظهر درنات ذات وزن طازج وجاف أعلى بنسبة 42 و61%، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، فقد سجلت هذه السلالة الخضرية زيادة بنسبة 10 و75% في محتوى النشا على أساس الوزن الجاف ومتوسط محتوى النبات من النشا، على التوالي. تحسين تراكم النشا يرتبط بستة جينات مرتبطة بتخليق النشا، وهي جينات AGPase،GBSS I،SBE I،SBE II،SS II وSS III. يوفر AGPase أجزاء الجليكوزيل الميتوزي اللازمة لتخليق الأميلوز والأميلوبكتين. GBSS مطلوب لاستطالة الأميلوز، في حين أن SBE I،SBE II،SS IIوSS III مسئولون عن الأميلوبكتين.
يهدف البحث الثالث الي إنشاء علامات SSR وظيفية مرتبطة مع الاختلافات في تراكم النشا في سلالات البطاطس الناتجة من الاختلافات الجسمية من الكالس. بالإضافة إلى الصنف الأصلي ليدي روزيتا، تم فحص أربعة عشر سلالة للبطاطس الناتجة من الاختلافات الجسمية من الكالس لمعرفة محتويات النشا والسكر بالإضافة إلى محتوى المادة الجافة. من بين السلالات المختارة، كان سلالة التي تحتوي على نفس محتوى النشا للصنف الأصلي والآخرى تمثل السلالة ذات محتوى النشا الأقل. تحتوي السلالات المتبقية على نسبة نشا أعلى مقارنة بالصنف الأصلي. كشفت النتائج المجمعة للموسمين الزراعيين عن وجود علاقة إيجابية معنوية بين محتوى المادة الجافة ومحتوى النشا، والتي كانت غائبة عند استبدال النشا بالسكريات القابلة للذوبان. كما تم تسجيل ارتباطات غير معنوية بين محتوى السكر ومحتوى النشا. استنادًا إلى إمكانية نقل علامات SSR بين الأنواع، تم استغلال ستة بادئات SSR تميز التباين في تراكم النشا في البطاطا الحلوة لتقييم التنوع الوراثي بين سلالات البطاطس المختارة. وقد اظهرت نتائج التحليل أنماطا مميزة وقابلة للتكرار مع 68 نمطا، منها 62 نمط متعدد الأشكال. هذا وقد قامت البادئات بتضخيم نطاقات فريدة خاصة بسلالات البطاطس. وقد عكست البادئات المستخدمة قوة تحليل عالية ظهرت في PIC قدرها 0.457 في المتوسط وتضخيم 44 حزمة فريدة، موزعة في جميع السلالات التى تمت دراستها باستثناء واحدة تحتوي على محتوى نشاء أعلى، مقارنة بالصنف الأصلي. تعد هذه البصمةالوراثية شرطًا أساسيًا لتجنيد السلالاتذات القدرة المميزة على تراكم النشا، والتي تم تناولها في هذه الدراسة، في برامج التربية التي تستهدف تحسين تراكم النشا في درنات البطاطس. من ناحية أخرى، إن فشل البادئات المستخدمة في إنشاء علاقة نسبية تتوافق مع محتوى النشا في السلالات الموجهة. يمكن أن يعزى ذلك إلى استخدام عدد قليل من البادئات التي لم تغطي نسبة كبيرة من الجينوم المستهدف.