Thesis (M.Sc.) -Cairo University, 2024.

Bibliography: pages 105-126.

The family Cucurbitaceae contains a variety of vegetables or
fruit crops are considered most important edible plants globally, next
to Solanaceae. Cucurbit crops are subjected to the infection with
several viruses including ZYMV, causing devastating disease
worldwide. The target of the present study was conducted to control
ZYMV-infection using Streptomyces species culture broth as an
efficient bio-agents having antiviral activities against virus
replication and symptoms expression. The results of the current
study could be summarized as follows:
1. The virus was isolated from naturally infected squash plants
grown at different locations within Giza governorate exhibiting
various symptoms of Zucchini yellow mosaic disease spread
worldwide such as severe mosaic, blisters and fruit
malformation. Identification of the virus based on biological and
physical tests as well as molecular biology DNA based
technique such Reverse transcription polymerase chain reaction
(RT-PCR).
2. RT-PCR approach was conducted using specific primers pairs
for each of the coat protein (CP), DAG, P1 (responsible of virus
replication and symptoms expression) and P3 genes. PCR
amplification with the specific primers pairs for each genes
resulted in molecular length approximately 1221, 458, 600 and
670 bp for partially CP, DAG, P1 and P3 genes, respectively.
101
3. The sequences of four genes (CP, DAG, P1 and P3) were
deposited to NCBI GenBank (National Central for
Biotechnology Information) under accession numbers i.e.,
OM925548.1, OM925549.1, OM925550.1 and OM925551.1,
respectively. Comparison of phylogenetic tree of genes‟
sequences such CP, DAG, P1 and P3 with the other
representative isolates submitted in the GenBank shared range of
nucleotide sequences identity between 87.1–95.6% for P1 and
93.3–97.7% for P3. While, it shared 75.9-100% and 38.2-97.7%
sequence identity for CP and DAG genes.
4. In the present work, substances derived by three Streptomyces
spp. were applied either individually or in mixtures as seed
priming and/or foliar spraying to induce systemic resistance
(SR), activate plant defense responses against ZYMV infection
and promoting squash growth under greenhouse conditions.
5. Application of Streptomyces spp. delayed initiating of symptoms
appearance to 10 days post inoculation (dpi) on the ZYMVinoculated plants compared with streptomyces-untreated/
ZYMV-inoculated plants (5-dpi). Also, the disease severity
(DS), infection rate (IR) were significantly reduced in the
streptomyces-treated/ZYMV-inoculated plants in comparison to
untreated streptomyces plants and inoculated with ZYMV,
indicating the protective role of streptomyces substances.
6. Further, application of Streptomyces spp. led to physiological
and metabolic changes in the treated squash plants. These
102
changes were measured after 10 days from the third applying as
plant parameters and physiological as well as metabolic changes
i.e., proline, total phenolic, chlorophyllous pigments (total
chlorophyll, chlorophyll a and chlorophyll b) and antioxidant
enzymes activities (CAT, SOD and GPx).
7. Applying substances derived from streptomyces resulted in the
highest values of amino acid proline (µmoles g-1 FW). Applying
T4 (mixture of three streptomyces) gave the highest values of
proline (89.27±5.1 & 80.91±8.4) followed by T3 ”S. griseus“
(48.8±0.13 & 43.12±5.6), T2 “S. rochei” (43.96±0.03 &
42.43±1.5) and T1 “S. sampsonii” (33.97±0.16 & 33.64±0.31)
respectively, in both seasons (2021 and 2022) compared with T7
(control, 28.45±0.20).
8. Concerning total phenolic (mg.100 g-1) compounds, T4 induced
a significant increase (191.2±3.26 & 133.1±9.73) followed by
T3, T1 and T2 through the two seasons (2021 and 2022)
compared with T7 (control, 62.26±3.99).
9. Regarding, the measurements of total chlorophyll (mg/g-1 FW)
in the Streptomyces treated/ZYMV-infected plants compared
with the control treatment (T7) displayed in (Fig. 13). Applying
the mixture treatment (T4) revealed the highest quantity of
(1.800±0.06 mg.g-1 FW) followed by T2 (1.770±5.0), T1
(1.610±0.03) and T3 (1.438±0.01) in season 2022 compared with
the control T7 (1.003±0.02).
103
10. The activity of antioxidant enzymes i.e., catalase (CAT),
superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx)
increased significantly after application of streptomyces culture
broth. Applying T4 achieved the highest activity of SOD,
reaching 87, 86 U/ml compared with 53 U/ml for the control
(T7) during seasons 2021 and 2022, respectively. Also, applying
each of streptomyces culture broth separately i.e., T3, T1 and T2
resulted in 83, 81 & 74 and 69, 67 & 64 U/ml in the seasons
2021 and 2022, respectively.
In case of CAT activity (U/L), spraying each of T4, T3, T1 and
T2 increased CAT activity to 1.475, 1.327, 0.940 and 1.263 U/L
compared with 0.733 (T7) in season 2021, respectively.
Meanwhile, same treatments in season 2022 resulted in 1.490,
1.250, 0.890 and 1.293 U/L compared with 0.888 (T7)
respectively.
Conferring, GPx activity was recorded as 0.258±0.0154,
0.128±0.001, 0.089±0.003 and 0.061±0.001 mU/ml in
streptomyces-treated/infected plants i.e., T4, T2, T3 and T1,
respectively in season 2021. Approximately, similar results were
recorded in season 2022.
11. Gas chromatography–mass (GC–Mass) analysis of the
substances derived from Streptomyces spp. revealed
fractionation of 44, 47 and 54 substances derived from S.
sampsonii; S. griseus and S. rochei, respectively. These three
strains were able to produce an antiviral Behenic alcohol (fatty
104
alcohol, docosanol) having the same characteristics (Retention
Time = 23.87, Molecular Weight=326, 661-19-8, Molecular
Formula C22H46O, MF=926, Area %= 9.89, Cas # = 661-19-8).
12. The substances derived from Streptomyces spp. were applied to
prove the role of antiviral activity of Behenic alcohol on the
expression of P1 gene responsible of virus replication and
symptom expression of Potyvirus species was evaluated using
PCR.
Results indicated that PCR amplification with the primers pair
(ZY229F/ZY838R) resulted in an approximately 600-bp product
within P1 gene expression in the streptomycesuntreated/ZYMV-infected plant as a positive control (P.C).
Application of the substances including antiviral Behenic alcohol
provided clues to down-regulate P1 gene expression in all
streptomyces-treated/ZYMV-infected plants. Application of the
treatments (T1, T4, T5, T6 and T4*) prior/post to ZYMVinfection resulted in an amplified faint band of P1 gene product
(600-bp) compared to the prominent one in the P.C. Also, T2 and
T3 resulted in moderately faint band, while there is no amplified
product in the healthy plant (N.C.). Further, the resulting faint
band illustrated above indicates to the high potential activity of
Behenic alcohol in down-regulate P1 expression might be due to
the high concentration of Behenic alcohol produced in the
mixture containing the three species together as illustrated
above.

تحتوي الفصيلة القرعية على مجموعة متنوعة من محاصيل الخضر التي تُعتبر من أهم النباتات الصالحة للأكل على مستوى العالم، بعد العائلة الباذنجانية. وتتعرض محاصيل القرعيات للإصابة بالعديد من الفيروسات بما في ذلك فيروس الزوكيني الاصفر(ZYMV)الذي يسبب مرضًا مدمرًا في جميع أنحاء العالم حيث تصل نسبة الإصابة وفقد المحصول أحيانًا إلى 100%. لذا فقد استهدف البحث مكافحة هذا الفيروس بوسائل المكافحة الحيوية بواسطة مُنتجات أو رواشح ثلاث أنواع من Streptomyces(مُعرفة سابقًا بواسطة تقنيات البيولوجيا الجزيئيةومُلحقة ببنك الجينات الدولي) كعوامل حيوية فعالة تحتوي على مركباتمختلفة ومنها مركب ذونشاط مُضاد وفعال ضد تضاعف الفيروس والتعبير الجينيي لأحد الجينات الهامة الموجودة ضمن جينوم الفيروس والمسمى جين P1المسئول عـن تضاعف الفيــروس والتعبيــر بظهور أعراض الإصابة، وهذاالجين يؤكد تعبيره ظهورباند بطول 600bpعند استعمال البادئات (ZY229F and ZY838R)المُتخصصة للكشف عنهفي العينات المصابة عندما تُختبر بعديد البلمرة المتسلسـل (RT-PCR). تــم تأكيــد نتائـج هــذا الاخـتبار السابق(RT-PCR)لتحديد معيار جـزيئات الفيروس داخــل النبات بعــد المعاملاتبالاستـربـتـــومــيـسيـس وذلـك بالاخـتـبـار الأدق والأكـثـــر حــسـاسيـةالمُــسمـى بـــQuantitative real-time reverse-transcription PCR (RT-qPCR)وعمومًا يمكن تلخيص نتائج الدراسة الحالية كما يلي:
ويمكن تلخيص النتائج المُتحصل عليها فيما يلي:-
1- فُحصتالحقول المنزرعة بنباتات الكوسة المًشتبه إصابتها طبيعيًا بالفيروس في أماكن مختلفة بمحافظة الجيزة، ثم جُمعت العينات وأُخذت إلى المعمل، وتم عزل الفيروس من الأوراق والثمار المصابةبأعراض مُختلفة لفيروسالزوكيني الأصفر مثل الموزايك - تحزم العروق- البثرات على الأوراق والثمار مسببة تشوهها، وتلك الأعراض متشابهة مع مثيلتها المنتشرة في جميع أنحاء العالم. وتم تعريف الفيروس بناءًا على الاختبارات البيولوجية (مثل النقل الميكانيكي على المدي العوائلي- والعوائل المشخصة) والفيزيائية (بالفحص بالميكروسكوب الإليكتروني) بالإضافة إلى تقنيات البيولوجيا الجزيئية المُعتمدة على الحمض النووي مثل تفاعل عديد البلمرة المتسلسل العكسي (RT-PCR).
2- تــم الكشف عن أربع جينات للفيروس بواسطة اختبار تفاعل عـديد البلمرة المتسلسل العكسي (RT-PCR) باستخدام أزواج البادئات المُحددة لكل من جين الغلاف البروتيني(CP)،وجين DAGالمرتبط دائمًا بجين الغلاف البروتيني، والجين P3، بالإضافة إلى الجين P1(المسؤول عنتضاعف الفيروس والتعبير عن ظهور أعراض الإصابة)،أدىاختبار الـPCRإلى تضخيمشظايا الحمضالنووي لبانداتbpبأطوالحوالي 1221و458 و600 و670 المُميزة للجينات CP،DAG،P1،P3على التوالي.
3- أيضًا تـــم عمل تفــــريــد لتتــــابعـــات الجينات الأربعة (CP و DAG و P1 و P3) وإيداعهمفي بنك الجيناتNCBI GenBank (المركز الدولي لمعلومات التكنولوجيا الحيوية) تحت الأرقام OM925548.1 و OM925549.1 و OM925550.1 و OM925551.1 على التوالي. وأيضًا تمت مقارنة نسبة القرابة في شجرة النشوء والتطور لتسلسل تلك الجينات CP وDAG وP1 وP3 مع العزلات المتماثلة الأخرى المتواجدة في بنك الجيناتوكانت تسلسلات النيوكليوتيدات ما بين 87.1-95.6% للجينP1 و93.3-97.7% للجينP3. في حينكانت نسبة القرابة 75.9-100% و38.2-97.7% للجينات CP وDAG على التوالي.
4- اهتمت الدراسة الحالية بتقييـــمتأثيرالمُركباتالتي تنتجها الثلاث أنواع من الاستربتوميسيسStreptomyces spp.(,S. griseusand S. rochei(S. sampsonii ، وتم تطبيقها بشكل فردي أو في مخاليط وذلك لمعاملة البذور للتهيئة (Seed priming) ثم معاملات الرش على المجموع الخضري بهدف استحثاث النبات لتنشيط المقاومة الجهازية (SR)، وتنشيط استجابات دفاع النبات ضد الإصابة بـفيروس الزوكيني الأصفر ((ZYMV وتحسين نمو النبات في ظل ظروف الصوبة الزجاجية.
5- أدت المعاملات بنواتج (رواشح) الـStreptomyces spp.إلى تأخر ظهور أعراض الإصابة إلى 10 أيـام بعد الحقن بـفيروسZYMVفي حيـن ظهرت الأعـراض بـعد 5 أيام على النباتات غير المعاملةبالاستربتوميسيسوالمحقونةبالفيروس فقط، أيضًا أدت المعاملات إلى تقليل شدة المرض (DS) ومعدل الإصابـة (IR) بشكل ملحوظ في النباتات المعاملة بالستربتوميسيس والمحقونةبـالفيروس مقارنـة بالنباتات غـيـرالمعاملة والمحقونة بالفيروس مما يشير إلى الدور الوقائي للمركبات المُنتجةبواسطة الستربتوميسيس.
6- أيضًا أدتالمعاملة بالمركبات المُنتجة من أنواع الــStreptomyces spp. إلى حدوث تغيرات فسيولوجية في نباتات الكوسةالمصابة بالفيروس والمُعاملة في نفس الوقت. تم تقدير التغييرات الفسيولوجية والأيضية بعد 10 أيام من التطبيق الثالث في مكونات النبات من: البروليـن-والفينـول الكلي والكلوروفيــل (الكلوروفيل الكلي، والكلوروفيل-أ والكلوروفيل-ب) ونشاط الإنزيمات المضادة للأكسـدة (الكتاليز CAT ، والسوبـر أوكسـيد ديسميوتيـز SOD، وجلوتاسيون بيرواوكسيديز GPx)وهي الإنزيمات المرتبطة بمقاومة النبات.
7- بالنسبة للحمض الأميني برولين: المعاملة بالمركبات المُنتجة من الاستربتوميسيس أعطت أعلى قيم للحمض الأميني برولين خاصة عند تطبيق المعاملةT4المكونة بخليط من الثلاث أنواع من الاستربتومايسيس حيث ارتفعت قيم البرولين إلى 89.27±5.1 ، 80.91±8.4 مللي مول/ لكل جرام أوراق، يليه المعاملةT3 بواسطة الاستربتوميسيس S. griseus (48.8±0.13 ، 43.12±5.6)، ثم المعاملة T2 بواسطة S. rochei 43.96±0.03 ، 42.43 ± 1.5) وأخيرا المعاملة T1 بواسطةS. sampsoniiأدت إلى ارتفاع قيمة البرولين إلى33.97 ± 0.16 ، 33.64 ± 0.31على التوالي في كلا الموسميــن (2021 و 2022) مقارنة بالمعاملةT7الكنترول (28.45 ± 0.20).
8- تقدير تأثير المعاملات بواسطة الاستربتوميسيس على معدلات المركبات الفينولية الكلية (ملجم/100جم1) لوحظ أنالمعاملةT4(خليط الثلاث عزلات) أحدثت زيادة معنوية مقدارها 191.2±3.26 & 133.1±9.73 أي بمعدل مرتين (بالموسم الثاني) إلى ثلاث مرات (بالموسم الثالث) تلتها المعاملاتT3،T1،T2خلال الموسمين (2021 و2022) مقارنة مع T7الكنترول (62.26±3.99).
9- قياسات الكلوروفيل الكلي (ملجم/جم أوراق) في النباتات المعاملة بالاستربتوميسيس/ والمصابة بالفيروس (ZYMV) مقارنة بالمعاملة الكنترول (T7) المحقونة بالفيروس فقط. أظهرت تجربة معاملة الخليط (T4) أعلى معدل (1.800±0.06) ملجم/جم1أوراق يليها المعاملة T2 (1.770±0.5)، ثم المعاملة T1 (1.610±0.03)، والمعاملة T3 (1.438±0.01)،في موسم 2022م مقارنة بالمعاملة T7 الكنترول (1.003±0.02).
10- تم أيضًا تقدير نشاط الإنزيمات المضادة للأكسدة مثل:الكتاليز (CAT)، والسوبـر أوكسـيد ديسميوتيـز (SOD) ، وجلوتاسيون بيرواوكسيديز (GPx)بعد تطبيق معاملات المركبات التي ينتجها الاستربتوميسيس. فقد حققتالمعاملةT4 (خليط المركبات المُنتجة للثلاث أنواع معًا)
أعلى نشاط للإنزيمSODحيث بلغ 87.86 وحدة/مل مقارنة بـ 53 وحدة/مل لمعاملة (نباتات محقونة بالفيروس فقط ) المقارنة (T7) خلال موسمي 2021 و 2022م على التوالي. أيضًا أدتالمعاملات الفردية لكل نوع على حدى لــ T3 وT1 وT2 إلى ارتفاع نشاط الإنزيم إلى 83، 81 و74، 69 و 67، 64 وحدة / مل على التوالي في المواسم 2021 و 2022م.
أما في حالة نشاط إنزيم (CAT)، أدى الرش بالمعاملاتT4 وT3 وT1 وT2 إلى زيادة نشاطه إلى 1.475 و1.327 و0.940 و1.263 وحدة/لتر وذلك عندما قورنت بـ 0.733 بالمعاملة T7 الكنترول في موسم 2021م على التوالي. وفي الوقت نفسهارتفع نشاط الإنزيمعند استخدام نفس المعاملات في موسم 2022م إلى 1.490، 1.250، 0.890 و1.293 وحدة / لتر مقارنة بـ 0.888 للمعاملة T7) على التوالي.
وعنـد تسجيـل نشــاط الإنــزيمGPxاعطــت النتائـج معـــدلات 0.258±0.0154 و 0.128±0.001 و 0.089±0.003و 0.061±0.001في النباتات المصابة بالفيروس والمعاملة بالاستربتوميسيسبالمعاملاتT4 و T2 و T3 و T1 على التوالي في موسم 2021م.
11- تحليل المركبات المُنتجة من الاستربتوميسيسStreptomyces spp. كروماتوغرافيا بواسطة الـGC–Mass أثبتت النتائج أن المنتجات تحتوي على 44 و47 و54 مركب مـن S.sampsonii ،S. griseus، S. rochei على التوالي. وكانت السلالات الثلاثة قادرة على إنتاج كحول مشبع ضمن مكوناته يُدعى كحول بيهيني (Behenic alcohol)وهو مٌضاد لتضاعف الفيروس (كحول دهنــي، الاسم التجاري Docosanol) وله نفس الخصائص من حيث الوزن الجزيئيفـي الثلاث أنواع يمكن ذكرها كما يلي:
(Retention Time = 23.87, Molecular Weight=326, Molecular Formula C22H46O, MF=926, Area %= 9.89, Cas # = 661-19-8.
12- تـم تقيـيـم تأثير فعل هـذا المـركـب ضمـن بـاقي المكـونات المُنتجـة بـواسطــة الأنــواع الثلاثــة مـن الــStreptomyces spp.حيث طُبقت لإثبات دورهكمضاد للفيروس محل الدراسة وذلك لتأثيره على تعبير جينP1الموجود ضمن جينوم فيروس الزوكيني (ZYMV) والمسئول عن تضاعف الفيروس وتطور المرض بظهور أعراضه(موزايك و فقافيق)على النباتات المصابة به،فقد تم التقييم بالكشف عن تواجد الفيروس في النباتات المحقونة به فقط ، بالمقارنةمع نباتات المحقونة بالفيروس والمعاملة بمُنتجات الثلاثة أنواع من الاستربتوميسيس سواء مُجتمعة أو منفردة وملاحظة اسباب اختفاء الأعراض على النباتات بعد المعاملة الثالثة بعشرة أيام.
في هذا الصدد تم الكشف عن تواجد الفيروس أولًا لتحديد إصابة النباتات من عدمه بالكشف باستخدامجهاز عديد البلمرة المتسلسل (RT-PCR). ثم الكشف لتحديد مدى الإصابة وومعيار او تعداد أوتركيز الفيروس داخل النباتبالكشف باختبارعـديد البلمرة المتسلسل الكمي.(Real-Time qPCR)
وأشارت النتائج إلى أن البادئات المتسخدمة (ZY229F / ZY838R) مع الـPCRأدت إلى تضخيم شظايا الحمض النووي لبانداتبأطوال bp600لكنها اختلفت في حدتها من الخافتة أوالضعيفة إلى أوالمتوسطة حسب المعاملات بمنتجات الاستربتوميسيس سواء مُنفردة أو مُجتمعة وذلك مقارنة بالباند المُميز أو شديد الوضوح في النباتات المحقونة بالفيروس فقط (كنترول) دون المعاملة بالاستربتوميسيس. وهذا دليل على تأثير كحول البيهيني كمضاد لتضاعف الفيروس وتعبير الجين P1المسئول عن تضاعف الفيروس في النباتات المحقونة بالفيروسوالمعاملة بمُنتجات الاستربتوميسيس مثلT1 وT4 وT5 وT6 وT4* وذلك عندمقارنتها بالنباتات المحقونة بالفيروس فقط وغير المعاملة بمُنتجات الاستربتوميسيس. أيضًا ظهر باند خافت إلى حد ما نتيجة المعاملة بــT2 وT3، في حين لا يظهر أي باند في النبات السليم وغير المعامل وغير المحقون بالفيروس.
وقد تم تأكيد نتائج الــRT-PCR باستخدام الكشف الآخرباختبارعـديد البلمرة المتسلسل الكمي(Real-Time qPCR)الأكثر دقة وكفاءة وحساسية في تحديد مدى الإصابة ومعيار أو تركيز الفيروس داخل النبات.وكلما كانت نتائج معادلة الــ ∆∆Ct دالة على المستويات تواجد الفيروس في العينةمرتفعة تشير بأن المعاملات T4, T2, T1 and T3احدثتتأثير للمضاد لتضاعف الفيروسبما يسمى down-regulation أي انخفاض تنظيم تعبير الجين P1 المسئول عن تضاعف الفيروس وظهور أعراض الإصابة مؤشرًا بانخفاض تعداد جزيئات الفيروس بالعينة مقارنة برقم معادلة ∆∆Ctالمنخفض مشيرًا إلى ارتفاع تنظيم تعبير الجين P1 مشيرًا بعدم تواجد الكحول البيهيني المضاد لتضاعف الفيروس،وبالتالي يكون تعداد الفيروس بالعينة عالي بعينة الكنترول T7 (المصابة بالفيروس فقط وغير معاملة بالاستربتوميسيس)أي أن هناك تناسبًا عكسيًا. والاستنتاج بأن المعاملات المحتوية على المركبات التي ينتجها الاستربتوميسيس تحتوي على الكحول البيهيني الذي أثبت كفاءته في تثبيط تعبير الجين P1المسئول عن تضاعف الفيروس وإظهار أعراض الإصابة للنبات المصاب، لذا لم يظهر الباند الممثل لوجود الجين أو يظهر ضعيفًا حسب المعاملات، وكذلك تخفت أعراض الإصابة بعد المعاملةبالاستربتوميسيس خاصة في حالة اشتراك الثلاثة في خليط واحد. وهذا الإثبات الأول عن قدرة أنواع الاستربتوميسيس الثلاثة في إنتاج هذا المركب كمضاد لتضاعف الفيروس.

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.