Impact of Some Long Noncoding RNAs Expression on the Occurrence and Development of Cerebral Stroke in Relation to Hypoxia Inducible Factor-1 in Egyptian patients / Rana Kamal El-Din Ahmed Zayed ؛ Amira A. Shaheen Hebatallah A. M. Darwish.

Thesis (M.Sc)-Cairo nivsersity,2022.

Bibliography: p. 100-123.

السكتة الدماغية هي الإصابة الناجمة عن اضطراب في إمداد الدم للدماغ مما يؤدي إلى العجز العصبي. وتعد أيضاً السبب الرئيسي للإعاقة الجسدية لدى البالغين والمسبب الثاني للوفاة على مستوى العالم. ويصاحب السكتة الدماغية العديد من المسارات الكيميائية الحيوية والجزيئية، والتي تؤدي الى موت الخلايا العصبية بسبب خلل في التوازن بين احتياج الأكسجين وإمداده الى النسيج الدماغي. وتمثل حالات نقص الأكسجين الناجمة عن السكتة الدماغية الوعائية تحديًا قويًا لخلايا الثدييات المعتمدة على الأكسجين والتي تتطلب استجابة خلوية كافية لضبط عمليات تكاثر الخلايا والتمثيل الغذائي بدقة. ويعد العامل المحفز لنقص الأكسجين-1 (HIF) اللاعب الرئيسي في الاستجابة الخلوية لنقص الأكسجين. كما يتم أيضاً تنظيم الأحماض النووية الريبوزية الطويلة غير الُمَشِفرة عند نقص الأكسجين إذ تعمل بشكل مباشر أو غير مباشر كمحفزات أو مثبطات لتعبير HIF. وقد تشارك الأحماض النووية الريبوزية الطويلة غير الُمَشِفرة أيضًا في تنظيم تكون الأوعية وكذلك العمليات الفيسيولوجية المرضية للسكتة الدماغية حيث يتم تغيير ملامح تعبيرها في الدم المحيطي لمرضى السكتة الدماغية. و تهدف هذه الدراسة إلى تقييم مستويات التعبير الجيني للأحماض النووية الريبوزية غير الُمَشِفرة (lncRNA HIF1A-AS2 and lncRNA LINK-A) بالإضافة الي الحمض النووي الرسول (mRNA HIF1-α) في مصل المرضى المصريين المصابين بمرض السكتة الدماغية (السكتة الدماغية التخثرية، السكتة الدماغية الصدعية و السكتة الدماغية النزفية) و قد ضمت الدراسة 75 مريضا من المرضى المصريين المصابين بمرض السكتة الدماغية، و25 متطوعا من الأصحاء المتماثلين في العمر والجنس لمعرفة مدى فعالية هذه القياسات كمؤشرات حيوية تشخيصية وإنذارية لتشخيص ومتابعة تطور المرض و تحديد الأليات الجزيئية المتورطة في حدوث مرض السكتة الدماغية الحادة. وقد تم تقسيم المشاركين المائة في البحث إلى أربع مجموعات على النحو التالي: • المجموعة الأولى: مجموعة ضابطة تتكون من خمس وعشرون متطوعاً من الأصحاء. • المجموعة الثانية: تتكون من خمسة وعشرين مريضاً مصاباً بالسكتة الدماغية التخثرية. • المجموعة الثالثة: تتكون من خمسة وعشرين مريضاً مصاباً بالسكتة الدماغية الصدعية. • المجموعة الرابعة: تتكون من خمسة وعشرين مريضاً مصاباً بالسكتة الدماغية النزفية. - تم الحصول على المرضى من عيادة السكتة الدماغية ، قسم الأعصاب ، مستشفى قصر العيني ، جامعة القاهرة من مارس 2019 إلى مارس 2020. تم إجراء التشخيص السريري المؤكد وتوصيف الأنواع الفرعية للسكتة الدماغية بواسطة طبيب أعصاب بناءً على التصوير المقطعي المحوسب أو التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ. - و قد تم سحب 5 ملل دم وريدي و فصل المصل و حفظه عند -٨٠ درجة من كل الحالات المشاركة في الدراسة (خلال ال 24 ساعة الأولى عقب الإصابة بالسكتة الدماغية)، و تم تعيين التعبير الجيني للأحماض النووية الريبوزية الطويلة غير الُمَشِفرة (lncRNA HIF1A-AS2 and lncRNA LINK-A) والحمض النووي الرسول HIF1-α باستخدام تقنية تفاعل البلمرة التسلسلي العكسي الكمي. كما تم تعيين مستويات (VEGF, ANG-1 and BDNF) باستخدام تقنية فحص المناعة الامتصاصية المرتبطة بالإنزيم بالإضافة الى مستويات (MDA and TAC) باستخدام طرق قياس اللون وكذلك تعيين مستوى بروتينات (PI3K, p-AKT, VEGFR2 and TIE2) باستخدام تقنية الويسترن بلوت. وتم جمع نتائج تحاليل مستويات الدهون (TAGs, Serum Cholesterol, HDL-Cholesterol, LDL, VLDL and Risk Ratio) وزمن البروثرومبين ونسبته من تقارير المرضى. - كل المرضى كانوا من الرجال والنساء البالغين فوق سن 35 سنة، و قد تم تشخيص إصابتهم بسكتة دماغية حادة وفقًا للفحص العصبي والتصوير الإشعاعي ، بما في ذلك ظهور مفاجئ لعجز عصبي بؤري لأكثر من 24 ساعة مع احتشاء مماثل في تصوير الدماغ والتصوير المقطعي المحوسب الذي يفرق بين التجلط في الشرايين الدماغية أو النزيف بسبب تمزق في الشرايين الدماغية ، في حين أن مخطط صدى القلب يشخص ما إذا كان تجلط الشريان الدماغي ناجم عن تضيق في الشرايين نفسها أو من انسداد مشتق من الشرايين القلبية. - مع استبعاد أي نوبة إقفارية عابرة حالية أو حديثة، وصدمات دماغية ، وتشوهات وعائية دماغية ، واضطرابات تخثر الدم ، وأمراض المناعة الذاتية ، والأورام ، وأمراض العدوى المزمنة. كما تم استبعاد أمراض الكلى والكبد والمعالجة المثلية وأمراض الشرايين المسدودة أو التجلط الوريدي للأطراف. - تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات و البحث العلمي للدراسات التجريبية والسريرية بكلية الصيدلة ، جامعة القاهرة ، القاهرة ، مصر ، برقم الموافقة: 2399. تم اطلاع كل المشاركين في الدراسة على ماهية البحث و أهميته و اخذت موافقتهم المستنيرة على المشاركة بالدراسة. - و قد أظهرت نتائج الدراسة ان مرضى السكتة الدماغية لديهم زيادة ذات قيمة احصائية في مستويات الدهون (Serum-Cholesterol, LDL, VLDL and Risk Ratio) مقارنة بالمتطوعين الاصحاء. - و اشارت النتائج أيضا الى وجود زيادة هائلة في مستويات التعبير الجيني للأحماض النووية lncRNA HIF1A-AS2 وmRNA HIF1-α، مصاحبها انخفاض هائل في مستوى التعبير الجيني للحمض النووي lncRNA LINK-A في مصل مرضى السكتة الدماغية مقارنة بالمتطوعين الاصحاء. - كما أظهرت النتائج وجود زيادة ملحوظة ذات قيمة معنوية عالية في مستويات التعبير الجيني للأحماض النووية lncRNA HIF1A-AS2 و mRNA HIF1-α في مصل مرضى السكتة الدماغية النزفية مقارنة بمرضى السكتة الدماغية التخثرية ومرضى السكتة الدماغية الصدعية.

و في المقابل، أظهر مرضى السكتة الدماغية التخثرية إنخفاضاً معنوياً في مستويات التعبير الجيني للأحماض النووية lncRNA HIF1A-AS2 وmRNA HIF1-α مقارنة بمرضى السكتة الدماغية الصدعية ومرضى السكتة الدماغية النزفية. و أوضحت النتائج أيضاً وجود زيادة في مستوى التعبير الجيني للحمض النووي lncRNA LINK-A في مصل مرضى السكتة الدماغية النزفية مقارنة بمرضى السكتة الدماغية التخثرية ومرضى السكتة الدماغية الصدعية. بينما لم يلحظ فرق ذا قيمة إحصائية في مستوى التعبير الجيني للحمض النووي lncRNA LINK-A بالمصل بين مرضى السكتة الدماغية التخثرية ومرضى السكتة الدماغية الصدعية. - وقد لوحظ سابقاً، أن زيادة HIF1-α مرتبطة بتثبيط تكسيره. كما تم اعتباره بمثابة مستشعر حساس للأكسجين البيولوجي ويساعد الكائن الحي على التكيف مع نقص الأكسجين عن طريق تنظيم تعبير الجينات ُالمَشِفرة، وبالتالي يحفز الإمداد الخلوي بالركائز التي توفر الطاقة والأكسجين. - كما وجد أيضاً أن HIF1A-AS2 يمكنه التحكم في وفرة HIF1-α من خلال العمل كـ ”إسفنجة” ل miR-153-3p ، والذي بدوره يقلل من تثبيط HIF1-α بعد النسخ. وعلى العكس من ذلك، يرجع إنخفاض LINK-A إلى دوره في تنشيط HIF1-α الأكسجيني بدلاً من HIF1-α ناقص الأكسجين. - أظهرت الدراسة أيضاً زيادة ملحوظة ذات قيمة احصائية في مستويات VEGF وANG-1 وكذلك مستوى المستقبلات الخاصة بهما، في حين انخفض مستوى BDNF في جميع المجموعات المصابة بالسكتة الدماغية مقارنةً بالمجموعة الضابطة. كما أوضحت النتائج وجود زيادة ذات قيمة إحصائية في مستوى البروتين VEGF في مصل مرضى السكتة الدماغية النزفية مقارنة بمرضى السكتة الدماغية التخثرية ومرضى السكتة الدماغية الصدعية، مع عدم وجود اختلاف فيما بينهما. كما اشارت النتائج الى وجود زيادة ملحوظة ذات قيمة إحصائية في مستوى البروتين ANG-1 في مصل مرضى السكتة الدماغية النزفية مقارنة بمرضى السكتة الدماغية التخثرية ومرضى السكتة الدماغية الصدعية، مع وجود انخفاض ملحوظ له قيمة إحصائية في مستوى البروتين ANG-1 في مصل مرضى السكتة الدماغية الصدعية مقارنة بمرضى السكتة الدماغية النزفية و السكتة الدماغية التخثرية. واشارت النتائج أيضاً الى عدم وجود اختلاف ذي قيمة إحصائية في مستوى البروتين BDNF في المصل بين جميع مجموعات السكتة الدماغية. و يرجع انخفاض مستوى BDNF الى مروره عبر الحاجز الدموي الدماغي أثناء حدوث اضطرابات به متعلقة بالسكتة الدماغية، مما يسبب زيادة في BDNF خارج خلايا الجهاز العصبي المركزي والتي صاحبها صورة انخفاض مستوياته بالدم. - لوحظ في هذه الدراسة وجود ارتباط إيجابي بين HIF1A-AS2 و HIF1- α و VEGF و ANG1 ، إلى جانب وجود ارتباط سلبي بين LINK-A و VEGF و ANG1. وبالتالي، أمكن الافتراض بأن مرض السكتة الدماغية، قد يؤدي إلى الإفراط في تعبير HIF1A-AS2 وانخفاض في تعبير LINK-A مما يزيد من تراكم HIF1-α، مع زيادة تحفيز العوامل المسببة لتكوين الأوعية الدموية وبدء سلسلة من تكوين الأوعية الجديدة. كما وجد أيضاً ارتباط سلبي بين lncRNA HIF1A-AS2 و HIF1-α و BDNF وارتباط إيجابي بين lncRNA LINK-A و BDNF، مما يشير الى الدور الوقائي لـ BDNF أثناء نقص الأكسجين. - كما أظهرت نتائج هذه الدراسة زيادة ملحوظة ذات قيمة احصائية في مستويات MDA و TAC في مصل مرضى السكتة الدماغية مقارنة بالمتطوعين الاصحاء، فضلاً عن زيادة ملحوظة ذات قيمة إحصائية في مستوى MDA في مصل مرضى السكتة الدماغية النزفية مقارنة بمرضى السكتة الدماغية التخثرية و مرضى السكتة الدماغية. في حين أشارت النتائج إلى عدم وجود اختلاف ذي قيمة إحصائية في مستوى MDA في المصل بين السكتة الدماغية التخثرية والسكتة الدماغية الصدعية. ودل ذلك على أن السكتة الدماغية تسببت في حالة من الإجهاد التأكسدي و زيادة إنتاج الشقائق الحرة والتي كانت أكثر شدة في السكتة الدماغية النزفية. إلا انه لم يظهر اي إختلاف في مستوى TAC في المصل بين مرضى المجموعات المصابة، مما يشير إلى أن التعويض ضد الإجهاد التأكسدي لم يتأثر بنوع السكتة الدماغية. بالإضافة إلى ذلك أشارت العلاقة الإيجابية بين MDA و TAC و lncRNA HIF1A-AS2 جنبًا إلى جنب مع ارتباطهما السلبي مع lncRNA LINK-A إلى الدور المقترح لهذه المؤشرات الحيوية في التحكم في التعبير الجيني ل lncRNAs وبالتالي ل HIF1-α. و بناءً على ذلك تم استخلاص ما يلي: • لأول مرة، يتم توثيق تغييرات في مستوى التعبير الجيني للأحماض النووية الريبوزية الطويلة غير الُمشِفرة؛ HIF1A-AS2 و LINK-A الى جانب مصل mRNA HIF1-α بين المرضى المصريين المصابين بالسكتة الدماغية الإقفارية والسكتة النزفية. • غالباً يحدث نقص في إمداد الأكسجين للدماغ عقب السكتة الدماغية، ويؤدي ذلك إلى زيادة إنتاج الشقائق الحرة ويحفز lncRNA HIF1A-AS2 و يثبط lncRNA LINK-A مما ينشط HIF1-α، الذي بدوره يعزز التعبير البروتيني لمستقبلات VEGFR2 وTIE2 بالإضافة إلى مستويات VEGF وANG1. • ارتبطت مستويات التعبير الجيني العالية لمصل HIF1-α وHIF1A-AS2 معاً، مع مستويات التعبير الجيني المنخفضة للـ LINK-A بتقدم السكتة الدماغية. • اثبتت الدراسة فاعلية استخدام الأحماض النووية الريبوزية الطويلة غير الُمشِفرة؛ HIF1A-AS2 وLINK-A كأدوات تشخيص وإنذار في جميع مرضى السكتة الدماغية، وخاصة المصابين بالسكتة الدماغية النزفية. • كان LINK-A أقوى مؤشر بيولوجي تنبؤي ذو قدرة عالية في تمييز مرضى السكتة النزفية عن مرضى السكتة الإقفارية.

• توصي الدراسة بإجراء دراسات مستقبلية متعددة المراكز على مجموعة كبيرة من مرضى السكتة الدماغية لتأكيد فاعلية هذه المؤشرات الحيوية كأدوات تشخيص وتنبؤ جديدة غير جراحية لرصد تطور نقص الأكسجين وإمكانية تكوين الأوعية الدموية في مرضى السكتة الدماغية.