Thesis (Ph.D)-Cairo University, 2025.

Bibliography: pages 222-258.

Breast cancer (BC) is the most prevalent cancer among females and a leading cause of
cancer-related death. Recent data shows that BC incidence has surpassed lung cancer,
representing nearly a quarter of female cancer cases. Unfortunately, current treatments are not only costly but show many side effects, creating an urgent need for alternative treatment strategies. One promising option is the repurposing of existing non-cancer drugs with known molecular targets. Angiotensin-II type-1 receptor blockers (ARBs) are a promising class of repurposed drugs for BC management.
BC tumor microenvironment (TME) is complex; it consists of diverse cell types, growth
factors, and signaling molecules that interact to promote malignancy, metastasis, and
treatment resistance. Cancer stem cells (CSCs) are key players within the TME, exhibiting stem-like properties that drive tumor growth, metastasis, and chemoresistance. CSC activity is governed by several molecules and signaling pathways, such as Src, phosphoinositide-3kinase (PI3K)/Akt, and insulin-like growth factor-1receptor (IGF-1R). Another critical component in the TME is cancer-associated fibroblasts (CAFs), which comprise the majority of breast tumor tissue, CAFs promote metastasis by reshaping the extracellularmatrix and maintaining the CSC pool. Receptors expressed on the cells residing in the breast TME are vital to regulating tumor progression. Notably, breast CSCs (BCSCs) express IGF-1R while CAFs express angiotensin-II type-1receptor (AT-1R). IGF-1R is acrucial receptor for CSC
maintenance and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) promotion. Interestingly, the transactivation of IGF-1R by AT-1R was studied in vascular smooth muscle cells but is still unexplored in BC. Moreover, the expression of AT-1R on BCSCs and IGF-1R on CAFs is still questionable. ARBs, such as valsartan (Val), inhibit AT-1R signaling and may limit tumor growth by disrupting IGF-1R signaling and CAF functions. Thus, ARBs hold the potential to reduce BC metastasis, drug resistance, and recurrence by modifying the TME and targeting dormant tumorigenic cells.
In the TME, cells communicate bby releasing nanovesicles called exosomes that carry
molecules like micro-RNA-21(miR-21), which further encourage tumor aggressiveness and resistance to treatments. Exosomes express the transmembrane protein, TSPAN8, a metastasis-promoting protein, that interacts with several receptor types expressed on the cells of the TME to activate specific signaling pathways within these cells. Exosome trafficking is regulated by a group of GTPases like Rab. This study explored the effects of the administration of Val to the dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-induced medroxyprogesterone acetate (MPA)-promoted BC model in rats, examining its
potential as a prophylactic treatment or as a therapeutic agent for targeted therapy. The study focused on two main objectives:
1-Examining the impact of prolonged AT-1R blockade (lasting over a year) on tumor
development and the effects of Val on key signaling interactions within the breast
TME cellular elements, particularly; BCSCs and CAFs) 2- Investigating the effect of targeting AT-1R expressed on BCSCs by a Val-targeted
formula after tumor development, on the BCSCs’ ability to secrete exosomes, the
expression of stemness markers, and tumor progression.
In the first chapter of the study, Val was administered at four escalating doses (10,20,40 and 80 mg/kg) to rats directly after aggressive BC induction, with treatment
continuing until the tumor appeared and reached a specific size. Results showed that blocking AT-1R with Val significantly reduced levels of both circulating and intratumoral ANG II, decreased AT-1R expression, and increased expression of the counteracting receptor Mas-R.
Additionally, Val lowered the expression of p-IGF-1R, which is typically elevated in BC,
particularly within the nucleus of TME cells. These changes suggest that Val may have a preventive role against BC progression. The study also examined the potential crosstalk between the AT-1Rand IGF-1R in BCSCs and CAFs, visualizing the expression of AT-1R on BCSCs and IGF-1R on CAFs and revealing that AT-1R and p-IGF-1R expression levels were highly correlated, particularly within CAFs. Blocking AT-1R by chronic Val administration significantly reduced both AT1R and p-IGF-1R levels in BCSCs and CAFs, with BCSCs being more affected. Importantly, in the untreated BC tissue samples, p-IGF-1R expression was highly correlated with the Src
gene expression, suggesting Src as a mediator for IGF-1R transactivation.
Downstream signaling pathways analysis revealed that Val reduced the expression of
Notch-1, the transcription regulator of IGF-1R, decreased the activation of the PI3K/Akt and interleukin-6(IL-6)/Jak/signal transducer and activator of transcription-3(STAT-3) pathways, and downregulated key factors essential for tumorigenesis, including NANOG (pluripotency marker), aldehyde dehydrogenase (ALDH) (stemness marker), N-cadherin (EMT marker), and vascular endothelial growth factor (VEGF) ( angiogenesis marker), indicating the effective abolishing of CSCs-regulating pathways by Val. Val prophylactic therapy also affected significantly suppressed tumor proliferation and growth. Tumors in Val-treated groups exhibited lower Ki-67expression, reduced volumes, and exhibited longer latency periods. Overall, these findings suggest that Val could serve as a dose-specific prophylactic
for BC, offering a novel approach to inhibit tumor-promoting pathways and potentially reduce therapeutic resistance in high-risk populations.
The second chapter of our study focused on targeting BCSCs and its overexpressed
receptor; AT-1R, using Val-loaded BCSCs-targeted nanoparticles (NPs). DMBA-induced MPA-promoted BC model was induced in rats. Val treatment was initiated once tumor size reached 1x1cm3. This approach aimed to evaluate the effects of Val on blocking AT-1Rs expressed on BCSCs in established tumors and the impact of this blockade on BCSCs stemness and tumorigenicity.
In this study section, Val was administered in three forms; conventional form, nontargeted liposomal form, and BCSC-targeted liposomal form. Val liposomes were prepared using the thin-film hydration method with an optimized lipid ratio. The targeted liposomes (Val-L-HA-CS NPs) were prepared bycoupling Val-loaded liposomes with hyaluronic acid (HA), as the first coat to target the cluster of differentiation-44(CD44) expressed on BCSCs, and chitosan (CS), as the second coat, to enhance mucoadhesion for oral delivery and provide additional binding to the CD44receptors on BCSCs. Liposomes were characterized regarding particle size, zeta potential, polydispersity index, drug entrapment efficiency, and in-vitro drug release profile. Targeting efficiency was assessed through the administration ofloading doses of Nile red-loaded HA and CS-coated liposomes to tumor-bearing rats and tracking localization of the fluorescently-labeled formula across different body organs and to the BCSCs labeled with anti-ALDH antibody conjugated with a fluorescently-labeled secondary antibody.The results of this experiment revealed successful BC targeting and excessive accumulation within the BCSCs.
The influence of different Val forms on the protein expression of AT-1R and IGF-1R
was investigated. The effectivenessof Val-L-HA-CS NPs to target BCSCs was assessed by measuring stemness markers; ALDH1A1and CD44. BC induction significantly upregulated AT-1R and p-IGF-1R expression. Blocking AT-1R with Val, whether in conventional form, Val-loaded liposomes, or targetedVal-loaded liposomes (Val-L-HA-CS NPs), significantly reduced AT-1R and p-IGF-1R protein levels, with the targeted Val liposomes showing the most pronounced effect. Treatment with Val-L-HA-CS NPs effectively downregulated the stemness markers; ALDH1A1and CD44.
Additionally, the impact of AT-1R blockade on breast cancer-derived exosome
secretion was examined by quantifying BC exosomal markers; TSPAN8, Rab25, and their cargo; miR-21. The study also evaluated the effect of each Val formula on tumor size, tumor grade, and tumor proliferationcontributing to understanding the therapeutic potential of targeted Val NPs to block AT-1R expressed on BCSCs in BC treatment.
Results revealed that the secretion of BC-derived exosomes was reduced, as indicated
by thedecreased levels of TSPAN8, Rab25, and miR-21. Blockade of AT-1R expressed on BCSCs by Val-L-HA-CS NPs resulted in the least expression of the proliferation marker; Ki67that was immunostained in tumor tissue, the most significant reduction in BC tumor volume, and tumor grade as compared to other Val therapeutic forms.
These findings demonstrate the potential of Val as an effective treatment for BC and
underscore the advantages of nanoformulations as an optimized delivery system for targeting the cellularcomponents of the TME, mainly; BCSCs.

يعد سرطان الثدي أكثر أنواع السرطانات شيوعاً بين النساء ويعتبر أحد الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان. تظهر الإحصائيات الحديثة أن عدد حالات سرطان الثدي في الاناث قد تجاوز سرطان الرئة، حيث تمثل ما يقرب من ربع حالات الإصابة بالسرطان لدى الإناث. علاجات سرطان الثدي الحالية ليست فقط مكلفة، ولكنها تسبب العديد من الآثار الجانبية، مما يستدعي استكشاف خيارات جديدة، بما في ذلك إعادة استخدام الأدوية غير السرطانية المعروفة بأهدافها الجزيئية كعلاجات. تعتبر مضادات مستقبلات الأنجيوتنسين من النوع الأول (AT-1R)، فئة واعدة من الأدوية المعاد توظيفها لعلاج سرطان الثدي.
بيئة الورم الدقيقة لسرطان الثدي معقدة وتضم أنواعًا مختلفة من الخلايا وعوامل النمو وجزيئات الإشارة التي تتفاعل لتعزيز الخباثة، والانتشار، ومقاومة العلاج. الخلايا الجذعية السرطانية داخل البيئة الدقيقة للورم تساهم في هذه التأثيرات، حيث تمتلك خصائص شبيهة بالخلايا الجذعية التي تدعم نمو الورم، وانتشاره، ومقاومته للعلاج الكيميائي. يتم تنظيم نشاط الخلايا الجذعية السرطانية بواسطة جزيئات ومسارات إشارة رئيسية، مثل Src, PI3K/Akt . وتعد الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان جزءاً آخر مهماً في البيئة الدقيقة للورم، حيث تشكل معظم نسيج الورم وتدعم الانتشار عن طريق إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية والحفاظ على الخلايا الجذعية السرطانية.
في بيئة الورم الدقيقة، تتواصل الخلايا من خلال إطلاق حويصلات دقيقه تُعرف بالإكسوزومات، والتي تحمل جزيئات مثل الميكرو-آر إن إيه، مثل miR-21، الذي يعزز من عدوانية الورم ومقاومته للعلاج. تعبر الإكسوزومات عن بروتينات غشائية، مثل Tspan8، ويتم تنظيم حركة الإكسوزومات بواسطة مجموعة من انزيمات ال GTPases مثلRab25.
يعد ومستقبل عامل النمو الشبيه بالأنسولين-1 (IGF-1R)مستقبلاً أساسياً للحفاظ على الخلايا الجذعية السرطانية وتعزيز التحول البارينكيمي للخلايا إلى الميزانكيمي. يمكن تنشيط مستقبل IGF-1R من خلال تنشيط غير مباشر بواسطة مستقبلات AT-1R. تعمل مضادات مستقبلات AT-1R، مثل فالسارتان على تثبيط مستقبلات AT-1Rوقد تقلل من نمو الورم من خلال تعطيل إشارات تعبير مستقبل IGF-1Rووظائف الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان، مما يجعلها ذات إمكانيات لتقليل انتشار سرطان الثدي، مقاومة الدواء، والانتكاسات من خلال تعديل بيئة الورم الدقيقة واستهداف الخلايا السرطانية الكامنة.
تمحورت هذه الدراسة حول استكشاف تأثيرات العلاج المزمن لمضادات مستقبلات AT-1R وتحديدًا عقار فالسارتان، في نموذج سرطان الثدي المستحث بالـ DMBA والمعزز بالـ MPA في الجرذان، وذلك من خلال دراسة فعاليته كعلاج وقائي أو كعلاج موجه. ركزت الدراسة على هدفين رئيسيين:
الهدف الأول: تأثير الحجب المطوّل لمستقبلات AT-1R باستخدام عقار الفالسارتان، والذي استمر لأكثر من عام، على تطور الورم، على التفاعلات الرئيسية للإشارات ضمن بيئة الورم الدقيقة في سرطان الثدي، و بالأخص في خلايا سرطان الثدي الجذعية والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان و أيضاً دراسة القدرة على تثبيط مستقبلات IGF-1R.
الهدف الثاني: دراسة تأثير استهداف مستقبلات AT-1R الموجودة على خلايا سرطان الثدي الجذعية بعد استحداث الورم، بواسطة تركيبة محملة بعقار الفالسارتان و موجهة لاستهداف خلايا سرطان الثدي الجذعية ، على قدرة خلايا خلايا سرطان الثدي الجذعية على إفراز الإكسوزومات، والتعبير عن علامات الخلايا الجذعية، وتطور الورم.
في القسم الأول من الدراسة، تم إعطاء عقار الفالسارتان بأربعة جرعات تصاعدية (10 و20 و40 و80 مجم/كجم) للجرذان مباشرة بعد استحداث سرطان الثدي العدواني، واستمر العلاج حتى وصل الورم إلى حجم محدد. أظهرت النتائج أن حجب مستقبلات AT-1Rبواسطة عقار الفالسارتان أدى إلى انخفاض ملحوظ في مستويات الأنجيوتنسين-II في الدم وفي داخل الورم، كما أدى إلى تقليل تعبير مستقبلات AT-1Rوزيادة تعبير مستقبل Mas-R الذي يعمل بصورة معاكسة. إضافةً إلى ذلك، قلل عقارالفالسارتان من تعبير مستقبل IGF-1R في صورته المفسفره الذي يرتفع عادةً في سرطان الثدي، خاصةً داخل نواة الخلايا الموجوده في بيئة الورم الدقيقة. تشير هذه التغيرات إلى أن عقار الفالسارتان قد يكون له تأثير وقائي ضد تطور سرطان الثدي لدى الأفراد المعرضين لمخاطر عالية.
كما فحصت الدراسة احتمالية التأثير المتبادل بين مستقبلات AT-1R ومستقبل IGF-1R في خلايا سرطان الثدي الجذعية والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان، حيث كشفت النتائج عن ارتباط قوي بين مستويات تعبير مستقبلات AT-1Rومستقبل IGF-1R، خاصة في الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. أدى حجب مستقبلات AT-1Rإلى تقليل مستويات تعبير مستقبلات AT-1Rومستقبل IGF-1R في صورته المفسفره في كل من خلايا سرطان الثدي الجذعية والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان، مع التأثير على خلايا سرطان الثدي الجذعية بشكل أكبر. علاوة على ذلك، أظهرت عينات الأنسجة المصابة بسرطان الثدي غير المعالجة أن تعبير مستقبل IGF-1R في صورته المفسفره مرتبط بشكل كبير بتعبير جين Src، مما يشير إلى دور Src كوسيط لتنشيط مستقبل IGF-1R. أظهرت تحليلات إشارات المسارات أن عقار الفالسارتان قلل من تعبير جينات Src وNotch-1، وخفف من تنشيط مساري PI3K/Akt و IL-6/Jak/STAT، وقلل من التعبير عن العوامل الأساسية لجذعية الورم، بما في ذلك NANOG (علامة تعدد قدرات الخلايا للتحول)، و ALDH ( علامة للقدرة الجذعية)، و N-Cadherin (علامة التحول البارينكيمي للخلايا إلى الميزانكيمي)، و VEGF (علامة لتكوين الأوعية الدموية)، مما يشير إلى أن عقار الفالسارتان قام بفاعلية بكبح خصائص الخلايا السرطانية الجذعية.
أثر علاج الفالسارتان أيضًا على تكاثر ونمو الورم. أظهرت الأورام في المجموعات المعالجة بعقار الفالسارتان انخفاضًا في تعبير مؤشر التكاثرKi-67، وانخفاضًا في أحجام الأورام، و زيادة فترات كمون الورم. ومن اللافت أن تأثيرات عقارالفالسارتان اتبعت استجابة على شكل منحنى الجرس، حيث أظهرت جرعة 20 مجم الفعالية القصوى، بينما كانت الجرعات الأعلى و الأقل منها أقل فعالية. تشير هذه النتائج بشكل عام إلى أن عقار الفالسارتان يمكن أن يكون علاجًا وقائيًا خاصًا بجرعة معينة ضد سرطان الثدي، مما يوفر نهجًا جديدًا لتثبيط المسارات المحفزة للورم وقد يساهم في تقليل المقاومة العلاجية لدى الفئات المعرضة لمخاطر عالية.
في القسم الثاني من الدراسة، تم التركيزعلى استهداف مستقبلات AT-1R التي تم اثبات تواجدها على خلايا سرطان الثدي الجذعية. تم استحداث سرطان الثدي في الجرذان بمادة DMBA وتعزيزه بواسطة MPA، ثم البدء بعلاج الفالسارتان عندما بلغت الأورام حجم 1x1سم³. كان الهدف من هذا القسم من الدراسة هو تقييم تأثير حجب مستقبلات AT-1Rفي الأورام المتقدمة، مع التركيز بشكل خاص على تأثيره على خلايا سرطان الثدي الجذعية ودورها في تطور الورم ومقاومته للعلاج. في هذا القسم من الدراسة، تم إعطاء عقار الفالسارتان في ثلاثة أشكال: الشكل التقليدي، الشكل الليبوزومي، والشكل الليبوزومي المستهدف لخلايا سرطان الثدي الجذعية. تم تحضير الليبوزومات المستهدفة لخلايا سرطان الثدي الجذعية عبر ربط الليبوزومات المحملة بعقارالفالسارتان مع حمض الهيالورونيك كطبقة أولى على الليبوزومات لاستهداف بروتين CD44 الموجود على خلايا سرطان الثدي الجذعية، والكيتوزان كطبقة ثانية على الليبوزومات لتعزيز الالتصاق المخاطي للتوصيل الفموي (Val-L-HA-CS NPs). تم تقييم الليبوزومات من حيث الخصائص الفيزيوكيميائية، حيث تم قياس حجم الجسيمات، وجهد زيتا، ومؤشر تعدد التشتت، وكفاءة احتجاز الدواء، ونمط إطلاق الدواء في المختبر.
تم تقييم كفاءة استهداف خلايا سرطان الثدي الجذعية من خلال إعطاء جرعات متتابعة من ليبوزومات محملة بصبغة فسفورية و مغلفة بحمض الهيالورونيك إلى جرذان حاملة للورم وتتبع استوطان تلك الليبوزومات في الورم و أعضاء الجسم المختلفة و تراكمها في خلايا سرطان الثدي الجذعية. كشفت نتائج هذه التجربة عن استهداف BCناجح لسرطان الثدي والتراكم داخل خلايا سرطان الثدي الجذعية.
تم التحقيق في تأثير أشكال عقار الفالسارتان المختلفة على التعبير البروتيني لكل من AT- 1R و IGF-1R . تم تقييم فعالية Val-L-HA-CS NPs لاستهداف خلايا سرطان الثدي الجذعية من خلال قياس علامات الجذعية، ALDH1A1 و CD44. أدى استحداث سرطان الثدي إلى زيادة التعبير عن AT-1R و p-IGF-1R بشكل كبير. بينما أدى استخدام عقار الفالسارتان، سواء في شكله التقليدي أو الليبوزومي أو الليبوزومي المستهدف لخلايا سرطان الثدي الجذعية، إلى تقليل مستويات بروتين AT-1R وp-IGF-1R بشكل ملحوظ، و كان التأثير الأكبر للليبوزومات المستهدفة. كما أدى العلاج باستخدام جسيمات Val-L-HA-CS NPsالنانوية إلى تقليل علامات الجذعية، ALDH1A1 و CD44، بشكل فعال.
بالإضافة إلى ذلك، تم فحص تأثير حجب AT-1R على إفراز الإكسوزوم المشتق من سرطان الثدي من خلال تحديد كمية علامات الإكسوزوم المشتق من سرطان الثدي؛TSPAN8 وRab25وحمولتهما؛ .miR-21 كما قيمت الدراسة تأثير تركيبات عقار الفالسارتان المختلفة على حجم الورم، مرحلتة، انتشاره، والهستوباثولوجيا الورمية له و ذلك لفهم الإمكانات العلاجية لجسيمات Val-L-HA-CS NPs في علاج سرطان الثدي.
كشفت النتائج عن انخفاض إفراز الإكسوزومات المشتقة من سرطان الثدي، كما يتضح من انخفاض مستويات TSPAN8 ، Rab25و miR-21. أدى حجب AT-1R المعبر عنه في خلايا سرطان الثدي الجذعية بواسطة جسيمات Val-L-HA-CS النانوية إلى خفض مستويات علامة الانتشار؛Ki-67، الذي تم صبغه مناعيًا في أنسجة الورم، وأظهر ذلك العلاج الانخفاض الأكبر في حجم ورم سرطان الثدي ودرجته مقارنة بأشكال عقار الفالسارتان العلاجية الأخرى.
توضح هذه النتائج فعالية عقار الفالسارتان كعلاج فعال لسرطان الثدي وتؤكد على مزايا الصيغ النانوية كنظام توصيل محسن لاستهداف المكونات الخلوية لبيئة الورم الدقيقة، وخاصة خلايا سرطان الثدي الجذعية

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.