Thesis (Ph.D)-Cairo University, 2024.

Bibliography: pages 74-87.

Climate change can adversely affect all living creatures and environmental resources. Agricultural activities contribute to climate change, by producing recalcitrant wastes. Herbivores gut is a rich niche with diverse microbial communities including anaerobic fungi (AGF) that function in the degradation of recalcitrant plant material in the gut. Expanding our knowledge about structural and functional fungi diversity in herbivores can reveal unexplored sources for agriculture waste biotransformation.
Here, DNA was extracted from fecal and rumen samples (64 cows, four buffaloes and four goats (family Bovidae) and four camels (family Camelidae)) of herbivores in Egypt, sequenced, and analyzed to characterize patterns of the AGF mycobiome diversity and community structure. The relative contribution of various ecological factors in shaping AGF community across various hosts was determined. Additionally, a simple mini gas station was developed and employed in the anaerobic enrichment of cellulose-degrading consortia and characterization of cellulose degradation activity.
The AGF diversity was much broader than previously implied, with 56 novel genera. Fecal and rumen mycobiome had a high overall diversity level, where 81 out of the 88 AGF genera in feces were present in rumen. Animal sex and strain, biogeography, and seasonal variation participated in shaping the rumen and fecal AGF community of cattle. Host-specific evolutionary processes (e.g. host families, species, and gut architecture) played a role in AGF evolution and diversification, suggesting a phylosymbiosis. Additionally, LIPA analysis recorded a few pairwise AGF genus-animal species associations. A pairwise comparison of the AGF mycobiome of rumen and feces, from the same animal, revealed a significantly greater diversity and inter-sample variability in rumen versus feces. Out of the six tested samples, four enriched anaerobic functional consortia had cellulase and carboxymethyl cellulase activities, with consortium S30 from cow feces having the highest carboxymethyl cellulase activities (39 IU/ml).
In conclusion, we provided a detailed exploration of AGF identity, biodiversity, and community structure in the Egyptian herbivores gut and identified the patterns of AGF variability between rumen and feces. The developed simple anaerobic station provided a means of characterizing the carbohydrate-degrading activities of the anaerobic consortia from herbivores gut that can be employed in different biotechnological applications

تقود الانبعاثات المتزايدة للغازات الدفيئة التغيرات المناخية، فقد بلغت أعلى مستوى لها على مدار التاريخ. وتؤثر التغيرات المناخية على المحاصيل الزراعية والماشية والتربة ومصادر المياه. كما تؤثر أيضا على المجتمعات الريفية والمزارعين. ومن ناحية أخرى فيساهم القطاع الزراعي في انبعاث كميات من الغازات الدفيئة للجو مما يفاقم من التغيرات المناخية. فالغازات الدفيئة مثل ثاني أكسيد الكربون والميثان وأكسيد النيتروجين تساهم بدور كبير في الاحتباس الحراري عالميا. وتنتج هذه الغازات بصفة أساسية أثناء التخلص من المخلفات الزراعية.
وتتكون المخلفات الزراعية من بقايا المحاصيل الزراعية بعد الحصاد ومعالجة المحاصيل لاستخلاص الأجزاء النافعة. وتتراوح المخلفات الزراعية في مصر بين حوالي 40 الى 45 طنا سنويا، يستخدم منها فقط حوالي 30% كسماد عضوي أو لتغذية الحيوانات. وتتكون المخلفات الزراعية بصفة أساسية من اللجنوسيليلوز والذي يحتوي على كربوهيدرات في صورة سيليلوز وهيميسيليلوز. لذلك يعتبر استخدام المخلفات الزراعية كمصدر للتصنيع فرصة واعدة، ليس فقط لتصنيع الأطعمة والمنتجات الحيوية والوقود الحيوي، ولكن أيضا يساعد على تقليل استهلاك الوقود الأحفوري وانبعاثات الغازات الدافئة. فعلى الرغم من اعتماد مصر على الزراعة، تستهلك مصر حاليا نسبة قليلة من تلك المخلفات في إنتاج الطاقة ولا تستغل أيا منها في إنتاج المواد الكيميائية والتي يمكن أن توفر بدورها كميات من الوقود المستورد في هذه الصناعات.
تعتبر أمعاء الحيوانات العاشبة مكانًا غنيًا بمجتمعات ميكروبية متنوعة جدًا بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا والفطريات والطفيليات والتي تعيش في توازن بيئي. وتعتمد الحيوانات العاشبة وخاصة المجترات منها، على هذا التنوع في جهازها الهضمي لهضم الألياف النباتية كمصدر أساسي للغذاء. حيث تنتج الميكروبات المعوية خليطا معقدا من الأنزيمات النشطة لتكسير مكونات الألياف النباتية مثل السيليلوز والهميسيليلوز والبكتن بكفاءة عالية. لذلك تعد ميكروبات الأمعاء مصادر غنية غير مستغلة، إلى حد كبير، للإنزيمات التي لديها إمكانية الاستخدام في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. لذلك سعينا من خلال هذا البحث لدراسة ذلك التنوع البيولوجي الهائل في أمعاء الحيوانات العاشبة ودراسة إمكانية استغلاله في تكسير الكربوهيدرات.
تلعب الفطريات اللاهوائية دورا أساسيا في تخمر الطعام نظرا لما تمتلكه من أنزيمات تكسير قوية للألياف النباتية وقدراتها على النمو الكثيف واختراق الألياف النباتية. لذلك فإن زيادة معرفتنا بالتنوع التكويني والوظيفي للفطريات اللاهوائية داخل أمعاء الحيوانات العاشبة في مصر يمكن أن يكشف عن طرق جديدة تساعد في التحول البيولوجي للمخلفات الزراعية الى مخلفات صديقة للبيئة وتساعد في العديد من تطبيقات البايوتكنولوجي باستخدام الأنزيمات النشطة لتكسير الكربوهيدرات.
في هذا البحث تم استخلاص الحمض النووي من عينات الروث والمعدة الأولى للحيوانات المجترة لعدد من الحيوانات العاشبة من مصر (أربعة وستون بقرة وأربع جواميس وأربع معزات وأربعة جمال)، وتم تحليل تتابعه الجيني باستخدام تقنية Illumina وكما تم استخدام تقنية SMRT PacBio لمجموعة مختارة من العينات لتوصيف النمط الخاص بالتنوع البيولوجي للفطريات اللاهوائية. وتمت دراسة مساهمة العوامل البيئية المختلفة في تشكيل مجتمع الفطريات اللاهوائية في العوائل المختلفة. بالإضافة لذلك تم تتطوير محطة غاز بسيطة لتستخدم في الإكثار اللاهوائي للمجتمعات الميكروبية المسئولة عن تحلل السيليلوز، كما تم توصيف قدرة تلك المجتمعات على تحلل السيليلوز.
تظهر نتائجنا أن نطاق تنوع الفطريات في أمعاء الحيوانات العاشبة أوسع بكثير مما تم الإشارة إليه في الدراسات السابقة. حيث أظهرت التحليلات النشئية المفصلة وجود تسلسلات غير مصنفة يمكن تجميعها في 56 فصيلة جديدًة، وتمت تسميتها NY1-NY56. كما تم إثبات امكانية دراسة التتابع الجيني في توصيف الفطريات اللاهوائية باستخدام تقنية Illumina، فقد تم تسجيل نتائج متشابهة مع تلك التي تم تسجيلها باستخدام تقنية SMRT PacBio. كما أظهر الميكوبيوم الفطري في الروث والمعدة الأولى للحيوانات المجترة مستوى عالٍ من التنوع العام، حيث تم تحديد واحدة وثمانون من أصل ثماني وثمانون فصيلة، من الفصائل الفطرية المكتشفة في الروث، في عينات المعدة الأولى للحيوانات المجترة.
وقد أظهر تحليل أنماط التنوع لبيانات الروث والمعدة الأولى للحيوانات المجترة أن عائلة الحيوان (نوع الأمعاء)، جنس الحيوان، سلالة الحيوان، وقت تجميع العينات، والجغرافيا الحيوية، أثرت بشكل كبير على تنوع ألفا. كما أثرت الأنواع الحيوانية بشكل كبير على تنوع ألفا في عينات المعدة الأولى للحيوانات المجترة فقط. وبصفة عامة، كانت العينات التي تنتمي إلى عائلة Bovidae (المجترات) أكثر تنوعًا بشكل ملحوظ مقارنة بتلك التي تنتمي إلى عائلة Camelidae (أشباه المجترات). وبين تلك الحيوانات (البقر، الجاموس، الماعز، الجمال)، كان مجتمع الفطريات اللاهوائية في المعدة الأولى للأبقار أكثر تنوعًا من المعدة الأولى للجمال. بالإضافة لذلك فقد اكتشفنا اختلافات ملحوظة في تنوع الألفا بناءً على جنس الحيوانات في الماشية، حيث كان الميكوبيوم الفطري من عينات الروث للإناث أكثر تنوعًا من ذلك الخاص بالذكور. وأظهرت أنماط التجميع المختلفة وتحليل PERMANOVA أن العوامل المرتبطة بالعائل تفسر نسبة أكبر بكثير من التباين الملحوظ للعينات، مقارنة بالعوامل الأخرى.
وتبين من خلال الدراسة، أن العمليات التطورية للعائل (مثل عائلاتهم، أنواعهم، وبنية الأمعاء) تلعب دورًا رئيسيًا في دفع عملية متوازية من تطور وتنوع الفطريات اللاهوائية، مما يشير إلى نمط من التعايش بينهما. كما أكد تحليل LIPA وجود بعض الارتباطات المحددة بين أجناس الفطريات اللاهوائية وأنواع الحيوانات. حيث أظهرت Caecomyces و Orpinomyces ارتباطًا معتدلًا، بينما أظهرت Cyllamyces و Neocallimastix ارتباطًا ضعيفًا مع المعدة الأولى الماعز. بينما سجلت Orpinomyces ارتباطًا قويًا مع المعدة الأولى الجاموس.
وقد أظهرت الدراسة انه بالإضافة إلى هوية العائل، يمكن أن تكون البيوجغرافيا (المنشأ) عاملاً إضافياً يؤثر على تنوع الفطريات اللاهوائية وبنية مجتمعها. فقد تمت ملاحظة اختلافات متعددة بين أنماط تنوع ألفا لعينات الماشية عند تقسيمها حسب بلد المنشأ/سلالة الحيوانات، حيث أظهرت عينات الروث، على عكس عينات المعدة الأولى من الماشية، أن عينات سلالات الماشية المحلية من مصر تتمتع بأنماط تنوع أعلى بشكل ملحوظ وبتباين أقل بين العينات مقارنة بالسلالات الأجنبية وعينات الماشية من الولايات المتحدة الأمريكية. وبذلك فقد أكدت نتائجنا مجتمعةً دور الجغرافيا في تشكيل تنوع الفطريات اللاهوائية وبنية مجتمعها. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت مقارنة تقديرات تنوع ألفا، وأنماط التجميع الترتيبي، وتحليل PERMANOVA لعينات الماشية المجمعة في مواسم مختلفة (الصيف، الخريف، والشتاء) اختلافات ملحوظة في مستويات التنوع وتكوينات مجتمع الفطريات اللاهوائية، حيث تم تسجيل تنوع أعلى في الصيف مقارنة بالخريف.
كما أظهرت المقارنة بين الميكوبيوم الفطري لعينات المعدة الأولى للحيوانات المجترة وعينات الروث المجمعة من نفس الحيوان تنوعًا أكبر بشكل ملحوظ وتباينًا بين العينات في عينات المعدة الأولى للحيوانات المجترة مقارنة بعينات الروث. وكانت الفصائل Neocallimastix وOrpinomyces موجودة بنسبة أكبر في عينات المعدة الأولى للحيوانات المجترة، بينما كانت Cyllamyces وCaecomyces متركزة في عينات الروث.
وبجانب التقييم المفصل لميكوبيوم الفطريات في المعدة الأولى للحيوانات المجترة والروث لدى الحيوانات العاشبة في مصر، قمنا باختيار بعض العينات لإنمائها بشكل لا هوائي من أجل الحصول على مجتمعات ميكروبية قادرة على تحلل السيليلوز باستخدام محطة غاز صغيرة بسيطة تم تطويرها لتحضير أوساط الاستنبات وتلقيحها لاهوائيا. وقد استخدمنا في دراستنا، طريقة سريعة لاختيار التكوين الوظيفي البسيط، قدر الإمكان، الذي يمتلك القدرة على تحلل السيليلوز، من خلال التخفيف المتسلسل للعينة الأصلية.
من بين العينات الست التي تم اختبارها، حصلنا على أربعة من المجتمعات الوظيفية القادرة على تحلل السيليلوز والكاربوكسي ميثيل سيليلوز. وقد أظهر التكوين المستخرج من عينة روث الأبقار (S30) أعلى مستوى لتحلل الكاربوكسي ميثيل سيليلوز بمعدل 39 وحدة دولية/مليليتر.
وختاما فقد أظهرت نتائجنا أن نطاق تنوع الفطريات في أمعاء الحيوانات العاشبة أوسع بكثير مما تم الإشارة إليه من خلال الدراسات السابقة. وقد تم تحديد المساهمة النسبية لعوامل بيئية مختلفة في تشكيل تجميع مجتمع الفطريات لاهوائية في العوائل المختلفة، وأظهرت أن العمليات التطورية الخاصة بالعائل (مثل تطور عائلات العائل، والأجناس، وبنية الأمعاء) لعبت دورًا رئيسيًا في دفع عملية متوازية من تطور الفطريات اللاهوائية وتنوعها. بجانب ذلك، اخترنا بعض العينات لأنمائها لاهوائيًا من أجل الحصول على تكوينات قادرة على تحلل السيليلوز. من بين ست عينات تم اختبارها، كان لدينا أربع مجتمعات وظيفية لها نشاط لتحلل كل من السيليلوز والكاربوكسي ميثيل سيليلوز بشكل لا هوائي.

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.