Thesis (M.Sc)-Cairo University, 2024.

Bibliography: pages 72-94.

Beta-glucosidase (BGL) is a crucial enzyme with extensive applications across biotechnology, environmental, and industrial sectors. This study focuses on the isolation, purification, and characterization of BGL-producing actinomycete from soil samples from Cairo University Garden. The most promising isolate, Streptomyces variabilis BGPA1, was identified and partially purified. The enzyme was immobilized on nanoflowers, confirmed by scanning electron microscopy (SEM) and Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR).
The immobilized enzyme facilitated the bioconversion of geniposide to genipin, which reacts with glycine to produce Gardenia blue, a natural dye for textiles and food industries. Optimal conditions for the immobilized enzyme were pH 6.0 and 50°C, with the nanoflowers retaining 94% activity after 15 cycles, indicating good recyclability.
The BGL gene from Streptomyces variabilis BGPA1 was cloned and overexpressed in E. coli BL21 using the pET-22b (+) vector. The expressed protein was isolated from the periplasmic space and purified via His-Tag affinity with Ni-NTA column, revealing a molecular weight of 50 kDa confirmed by SDS-PAGE. The recombinant enzyme's activity was optimal at pH 6.0 and 50°C, showing excellent thermal stability at these conditions and moderate stability at 60°C, with a specific activity of 132 U/mg protein.
In silico analysis revealed 100% identity of the deduced amino acid sequence with β-glucosidase from Streptomyces variabilis and high similarity with other Streptomyces species. The enzyme, classified within the glycosyl hydrolase 1 family, demonstrated several highly conserved domains, a stable instability index of 39.07, a theoretical isoelectric point (pI) of 5.41, and a molecular weight of 50.714 kDa.

إن إنزيم بيتا-غلوكوزيداز (BGL) Beta-glucosidase هو إنزيم مهم وله تطبيقات كبيرة في مجالات التكنولوجيا الحيوية، والبيئة، والصناعة. في هذه الدراسة، تم عزل وتنقية أحد الأكتينوميسيتات المنتجة لإنزيم بيتا-غلوكوزيداز من عينات التربة التي جُمعت من حديقة جامعة القاهرة. تم تحديد العزلة الأكثر وعدًا في إفراز بيتا-غلوكوزيداز وهي السلالة Streptomyces variabilis BGPA1 .
تم تثبيت الإنزيم المنقى جزئيًا بنجاح على الأزهار النانوية (جسمات نانويه لها شكل الزهرة)، والتي تم تأكيدها باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وتحليل المطيافية بالأشعة تحت الحمراء (FTIR) . تم استخدام الإنزيم المثبت على جزيئات النانو بفعالية في تحويل الجينيبوسيد إلى الجينيبين، والذي يتفاعل مع الجلايسين لإنتاج الصبغة الزرقاء (Gardenia blue)، وهي صبغة طبيعية تُستخدم على نطاق واسع في صناعات النسيج والغذاء وتُعد صديقة للبيئة.
وُجد أن الظروف المثلى لنشاط الإنزيم المثبت هي درجة حموضة 6.0 ودرجة حرارة 50 درجة مئوية. احتفظت هذه الأزهار النانوية، المحضرة بتهجين بيتا-غلوكوزيداز مع فوسفات النحاس، بنسبة 94% من نشاطها الأولي بعد 15 دورة من الاستخدام المتكرر، مما يدل على إمكانية إعادة التدوير وإعادة الاستخدام في نظام التحفيز الحيوي .
تم استنساخ وسلسلة جين بيتا-غلوكوزيداز من Streptomyces variabilis BGPA1 بنجاح. تم التعبير عن جين BGL في Escherichia coli BL21 باستخدام نظام الناقل pET-22b (+) . ثم تم عزل البروتين المعبر عنه، والذي يقع في المساحة المحيطة بالغشاء الخلوي لـبكتيريا E. coli، وتنقيته باستخدام طريقة تنقية ارتباط الوسم الهيستيديني (His-Tag) مع عمود Ni-NTA.
كشفت التحليلات باستخدام ادوات المعلوماتية الحيوية ان التسلسل نيوكليوتيدي بطول 1383 قاعدة يشفّر بروتينًا مكونًا من 460 حمضًا أمينيًا بوزن جزيئي تقريبي يبلغ 50.714 كيلو دالتون وهو لانزيم إنزيم بيتا-غلوكوزيداز (BGL) و ان الانزيم ينتمي تصنيفيا الى عالئلة glycosyl hydrolase 1 family. تم تنقية البروتين المؤشب و المعبر عنه ، وتم تحديد وزنه الجزيئي بأنه 50 كيلو دالتون باستخدام تحليل الرحلان الكهربي لهلام متعدد الأكريلاميد (SDS-PAGE) وهو ما يتوافق مع الحجم المتنبأ به .
تم تقييم النشاط الإنزيمي باستخدام ركيزة p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG). حيث أظهر الإنزيم نشاطًا أمثلًا عند درجة حموضة 6.0 ودرجة حرارة 50 درجة مئوية. علاوة على ذلك، أظهر الإنزيم استقرارًا حراريًا ممتازًا عند 50 درجة مئوية واستقرارًا معتدلًا عند 60 درجة مئوية. قُدر النشاط النوعي للانزيم بأنه 132 وحدة/ملجم بروتين.
تسلط هذه النتائج الضوء على إمكانية استخدام بيتا-غلوكوزيداز في التطبيقات التكنولوجيا الحيوية المتنوعة.

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.