Crosstalk between renin angiotensin system and neuropilin pathways in adjuvant-induced rheumatoid arthritis in rats /
الارتباط المتبادل بين نظام رينين أنجيوتنسين ومسارات نيوروبيلين فى التهاب المفاصل الروماتيزمى المستحدث فى الجرذان
by Nourhan Essmat Abdelghany Basiyony Shahin ; Supervision Prof. Mahmoud M. Khattab, Prof. Nesrine S. El-Mezayen.
- 181 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (M.Sc)-Cairo University, 2025.
Bibliography: pages 152-181.
Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease characterized by inflammatory arthritis, predominantly affecting synovial joints, with extra-articular involvement. Neuropilin-1 (NRP-1) expression is evident in synovial tissue and has been implicated in different aspects of RA pathogenesis via binding different ligands. Among these ligands, NRP-1 binding to either semaphorin 3A (Sema3A) or vascular endothelial growth factor-165A (VEGF-165A) plays a key role in inflammation, angiogenesis, bone resorption, and immune cell activation through the modulation of downstream signaling such as the extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2) and RhoA signaling pathways. The renin-angiotensin system (RAS) plays a significant modulatory role in inflammation and tissue injury. Angiotensin II (Ang II) enhances the production of pro-inflammatory cytokines, including IL-1, IL-6, and TNF-α. Further, Ang II interaction with the angiotensin II type 1 receptor (AT-1R) augments the local synthesis of VEGF-A, Moreover, Ang II induces osteoclastogenesis by upregulating receptor activator of nuclear factor kappa beta ligand (RANKL) expression. The present study primarily aimed at investigating the crosstalk between the RAS and NRP-1 pathways in RA. Furthermore, this study evaluated the effects of RAS modulating agents as compared to the standard of care, methotrexate (MTX), concerning bone remodeling and RA hallmarks biochemically and histopathologically. In addition, joint morphology was evaluated by scanning electron microscope (SEM) imaging. RA was experimentally induced in rats through intra-articular injection of 100 μL complete Freund's adjuvant (CFA). At day 19 post-induction, treatment commenced, with rats receiving oral MTX (0.5mg/kg/3 times/week), valsartan (VAL) (30 mg/kg/day), and ramipril (RAM) (10 mg/kg/day) for 14 days. Knee joint swelling was assessed weekly via Vernier caliper measurements of the knee-joint diameter. The impact of RAS system blockade on NRP-1 dimerization and ligand-binding domains was investigated in joint tissues through Immunohistochemical staining and western blot analysis, respectively, employing antibodies specific to CUB a1, FV/FVIII b2, and TM domains. Furthermore, the expression levels of NRP-1 ligands (VEGF-165 and Sema-3A) and RhoA/p-ERK signaling molecules were quantified using the quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Additionally, circulating RA marker (anti-cyclic citrullinated peptide (Anti-CCP)), the inflammatory markers; TNF-α, and IL-1β, as well as the bone remodeling marker; RANKL, were assessed via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Moreover, knee joints and synovial tissues underwent visualization using scanning electron microscopy (SEM), with subsequent morphometric analysis of the resulting electron micrographs to detect the percentage erosions in the cartilage surface of the joint and the nearby bone surface. Histopathological evaluation of knee joint tissue sections stained with haematoxylin and eosin (H&E) was performed to assess inflammation and bone remodeling. Our results shows there is an extensive crosstalk existing between the RAS and NRP-1 pathways in RA and RAS blockade via blocking AT-1R rather than ACE inhibition significantly reduced the expression of NRP-1 ligands, ligand-binding domains, and dimerization domains.In conclusion, VAL dually interfered with two major pathways affecting RA pathology; RAS and NRP-1, with subsequent down regulation of the downstream signaling molecules; p-ERK and RhoA, subsiding inflammation and promoting bone growth evidenced biochemically and histopathologically. يعد التهاب المفاصل الروماتيزمى (RA) مرض مناعي ذاتي يتميز بالتهاب المفاصل، ويؤثر بشكل رئيسي على المفاصل الزليلية. تم تأكيد تواجد مستقبلات النيوروبيلين-1 (NRP-1) في الأنسجة الزليلية للمفاصل، وقد ثبت تورطه في جوانب مختلفة من مسببات التهاب المفاصل الروماتيزمى من خلال ارتباطه بالربائط مختلفة. يلعب ارتباط NRP-1 إما بالسيمافورين3A (Sema3A) أو عامل نمو بطانة الأوعية الدموية A165 (VEGF-165A) دورًا رئيسيًا في عمليات الالتهاب، تكوين الأوعية الدموية، امتصاص العظام، وتنشيط الخلايا المناعية من خلال تعديل إشارات المسارات المختلفة، مثل مسارات كيناز 1/2 المنظم للإشارات خارج الخلية (ERK1/2) ومسارات إشارات RhoA. يلعب نظام الرينين-أنجيوتنسين (RAS) دورًا مهمًا في عمليات الالتهاب. يُعزز الأنجيوتنسين (Ang II)II من إنتاج السيتوكينات المُحفِّزة للالتهابات، بما في ذلك IL-1 ،IL-6، وTNF-α. علاوةً على ذلك، يُعزِّز تفاعل Ang II مع مُستقبِل الأنجيوتنسين II من النوع الأول (AT-1R) الافراز الموضعي لـ VEGF-A،. كما يُحفِّز Ang II تكوين الخلايا المسببة لتآكل العظم عن طريق زيادة التعبير عن RANKL. تهدف هذه الدراسة بشكل رئيسي إلى دراسة التفاعل بين مسارات RAS وNRP-1 في التهاب المفاصل الروماتيزمى. علاوة على ذلك، قيّمت هذه الدراسة آثار العقارات المختلفة التي تعمل على تعديل RAS مقارنةً بالعلاج القياسي، وهو الميثوتريكسات(MTX) ، فيما يتعلق بإعادة تكوين العظام ومؤشرات التهاب المفاصل الروماتيزمى من الناحيتين الكيميائية الحيوية والنسيجية. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم مورفولوجيا المفاصل باستخدام التصوير بالمجهر الإلكتروني الماسح. تم استحداث التهاب المفاصل الروماتيزمى تجريبيًا لدى الجرذان من خلال حقن 100 ميكرولتر من مساعد فرويند الكامل (CFA) داخل المفصل. وفي اليوم التاسع عشر بعد الاستحداث، بدأ العلاج، حيث تلقت الجرذان MTX فمويًا (0.5 ملجم/كجم/3 مرات أسبوعيًا)، وفالسارتان (VAL) (30 ملجم/كجم/يوميًا)، وراميبريل (RAM) (10 ملجم/كجم/يوميًا) لمدة 14 يومًا. تم تقييم تورم مفصل الركبة أسبوعيًا باستخدام الفرجار فيرنيه لقياس قطر مفصل الركبة. تم قياس مستويات التعبيرالجيني عن ربيطات VEGF-165A و Sema-3A وجزيئات إشارات RhoA/p-ERK باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qRT-PCR). كما تم قياس مؤشر علامة التهاب المفاصل الروماتيزمى ببتيد مضاد للسيترولين الحلقي الدائري(Anti-CCP)، ومؤشرات الالتهاب:TNF-α، وIL-1β، بالإضافة إلى مؤشر إعادة تكوين العظام:RANKL، باستخدام تقنية (ELISA). كما خضعت مفاصل الركبة والأنسجة الزليلية للتصوير باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح، مع تحليل مورفومتري للصور المجهرية الإلكترونية للكشف عن نسبة التآكل في سطح غضروف المفصل وسطح العظام المجاورة له. كما أُجري تقييم نسيجي لمقاطع من أنسجة مفصل الركبة ممصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوزين. وفقا للنتائج، فإنه تم إثبات وجود تفاعل متبادل واسع بين مسارات RAS وNRP-1 في التهاب المفاصل الروماتيزمى حيث أدى حصار RAS عبر غلق مستقبلات - AT-1R و بدرجة أقل عبر تثبيط الإنزيم المحول للأنجيوتنسين - إلى انخفاض كبير في مستويات ربيطات VEGF-165A وSEMA3A، مواضع ارتباط مستقبلات NRP-1 بالربائط المختلفة، والمجال المسئول عن ازدواجية تلك المستقبلات. فى الختام، نجح VAL بالتدخل في عمل مسارين رئيسيين يؤثران على أمراض التهاب المفاصل الروماتيزمى: RAS وNRP-1، مع انخفاض مستويات الاشارات الجزيئية التابعة لهما: p-ERK وRhoA، مما أدى إلى تقليل الالتهاب وتعزيز نمو العظام، وهو ما تم إثباته كيميائياً ونسيجياً