Thesis (Ph.D)-Cairo Univsersity,2022

107-126:Includes bibliogriphical references.

Polyhydroxybutyrate (PHB) is¬ a natural biodegradable polymer which can act as a good substitute to petrochemical-based plastics. The screening was done using 38 bacterial isolates where 15 isolates were found to be positive for PHA production. The bacterial isolate 6N-NRC was found to be the best producer of PHA. The extracted PHA was examined using NMR which confirmed that it belongs to polyhydroxybutyrate (PHB) category. Molecular characterization of the selected bacterial isolate (6N-NRC) revealed that it is Bacillus aryabhattai. This isolate was submitted to the NCBI Gene Bank with nucleotide sequence database under accession no. MH997667.1. The optimization of fermentation processes and strains for production of PHB from economic carbon source is required for the competition with synthetic plastics. Shaken flask experiments were conducted where the culture medium and growth parameters were optimized using one factor at a time as well as multifactorial experimental design (Plackett-Burman and Box-Behnken). Beet molasses was utilized as an economic substrate for the production of PHB and several methods were applied to make it bioavailable for the local bacterial isolate, Bacillus aryabhattai MH997667.1. Beet molasses (30 g/l) as the carbon source and ammonium chloride (0.75 g/l) as the nitrogen source were observed to be the best sources of nutrients for the optimum production of PHB. Incubation period 36 h, pH 8.0 and temperature 30ºC were found to be the best conditions for obtaining optimum PHB yield of 3.799 g/l. Batch fermentation was conducted using 5L-bench top bioreactor in order to control the process parameters. The optimum agitation speed was 250 rpm. The highest yield of PHB (2.3 g/l) was obtained at 24 h fermentation period. Logistic equation and Luedeking-Piret equation were used to describe biomass growth and PHB production accurately. MATLAB software 2019 was used to simulate the experimental process and the simulated data showed a good fit with the experimental results obtained during the first 24 h of PHB production at 250 rpm. The present work also aimed to study the genes responsible for the production of polyhydroxybutyrate (PHB) like acetoacetyl-CoA reductase (phbB) and polyhydroxybutyrate synthase (phbC). Appropriate primers were designed for phbB and phbC PCR approach. The phbB (744 bp) and phbC (1089 bp) genes were successfully isolated, identified and cloned with the pET-29a(+) plasmid vector. Transformation of Escherichia coli BL21 was performed. The amplification of the phbB and phbC genes using specific primers of pET-29a(+) plasmid was done. Based on DNA sequencing, the open reading frame of phbB sequence was found to be 99.06% identical to the sequence of acetoacetyl-CoA reductase of B. aryabhattai (GenBank accession no. CP024035.1), while the open reading frame of phbC sequence was found to be 87.18% identical to the sequence of polyhydroxybutyrate synthase of B. aryabhattai (GenBank accession no. CP024035.1). The analysis of the recombinant proteins from E. coli BL21 recombinant colony by tricine-polyacrylamide gel electrophoresis clarified that the expressed phbB and phbC genes in E. coli BL21 strain showed distinct bands of molecular weights 26.3 KD and 37.5 KD, respectively.

ثم تحليل البولى هيدروكسى الكانوات المستخرج باستخدام تقنيات الرنين المغناطيسى النووي التي أظهرت أنه ينتمى إلى البولي هيدروكسي بيوترات. تعرضت العزلة البكتيرية المختارة (6N-NRC) للتوصيف الجزيئي الذي اظهر بوضوح أنها سلالة باسيلس أريابهاتاى و قد تم تقديمها إلى بنك الجينات NCBI مع قاعدة بيانات تسلسل النيوكليوتيدات تحت رقم الانصمام MH997667.1. إن تحسين عمليات التخمير والسلالات التي تسمح بإنتاج البولي هيدروكسى بيوترات من مصدر كربوني غير مكلف مطلوب للتنافس مع البدائل الاصطناعية وتقليد خصائصها المرغوبة. أجريت تجارب الدورق المهتز حيث تم تحسين الوسط الغذائي وظروف النمو باستخدام عامل واحد فى كل مرة وتصميم تجريبي متعدد العواملPlackett-Burman و Box-Behnken. تم استخدام نفايات مولاس البنجر كمادة وسيطة لإنتاج البوليمر الحيوي، بناء على تطوير تقنيات مختلفة لجعل هذه العناصر الغذائية متاحة بيولوجيا لبكتيرية باسيلس أريابهاتاى MH997667.1 لإنتاج البولي هيدروكسي بيوترات. تم التوصل إلى أن مولاس البنجر (30جم/لتر) كمصدر للكربون وكلوريد الأمونيوم (0.75جم/لتر) كمصدر للنيتروجين هما أفضل المصادر الغذائية للوصول لأقصى إنتاج للـبولي هيدروكسي بيوترات. وجد أن مدة التحضين 36ساعة ، ودرجة الحموضة للوسط8.0 ودرجة حرارة 30 °هم الظروف المثلى للحصول على أقصى عائد للـبولي هيدروكسي بيوترات يبلغ 3.799جم/ لتر. تم إجراء تجارب المخمر المعملي باستخدام مخمر بسعة 5 لتر من أجل التحكم في معاملات العملية الانتاجية. وجد أن سرعة التحريك المثلى هي 250 دورة في الدقيقة. تم الحصول على أعلى إنتاجية من البولى هيدروكسى بيوترات (2.3 جم / لتر) في فترة التخمير 24 ساعة. تم استخدام المعادلة اللوجستية ومعادلة Luedeking-Piret لوصف نمو الكتلة الحيوية وإنتاج البولي هيدروكسي بيوترات بدقة. تم استخدام برنامج MATLAB 2019 لمحاكاة العملية التجريبية وأظهرت بيانات المحاكاة توافقًا جيدًا مع النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها خلال أول 24 ساعة من إنتاج البولي هيدروكسي بيوترات باستخدام سرعة تقليب 250 دورة في الدقيقة. يهدف العمل الحالي أيضا إلى دراسة الجينات المسؤولة عن إنتاج البولي هيدروكسي بيوترات مثل acetoacety-CoA reductase phbB و phbC polyhydroxybutyrate synthase. تم تصميم مواد أولية مناسبة لعزل و نسخ الجينات(phbB)، (phbC). تم بنجاح عزل جينات phbB، phbC واستنساخها وتم تحديد PCR amplicon 1089,744 bp المقابلة لجينات , phbB phbC. تم التحول البكتيرى للإيشيريشيا كولاى Bl21. تم إجراء تضخيم جينات phbB، phbC باستخدام بادئات محددة لبلازميد (+)pET-29a. قد اوضحت النتائج أن تسلسل phbB متطابقاً بنسبة 99.06% مع تسلسل acetoacety-CoA reductase لسلالة باسيلس أريابهاتاى CP024035.1، بينما وجد أن تسلسل phbC متطابق بنسبة 87.18% لتسلسل polyhydroxybutyrate synthase لسلالة باسيلس أريابهاتاى CP024035.1 بعد تسلسل الحمض النووي. أوضح تحليل البروتينات المؤتلفة من الإيشيريشيا كولاى BL21 المؤتلفة بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام tricine-polyacrylamide أن جينات phbB وphbC المعبر عنها فى سلالة الإيشيريشيا كولاىBL21 أظهرت نطاقات مميزة من الوزن الجزيئى37.5 KD و 26.3 KDعلى التوالي

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.