Thesis (M.Sc.)-Cairo University, 2022.

Bibliography: pages 34-45.

The aim of this study is to search for compounds with antibacterial effect against Multi-drug resistant Gram negative bacteria.
It was proven by several studies that the interactions between bacteria and fungi can potentially induce the secretion of secondary metabolites, the bacterial fungal interaction was utilized in vitro using co-culturing through the following steps:
• Isolation of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae from ICU patients with confirmed blood stream infection.
• Isolation of different fungal species from multiple localities Ex: soil, hospital environment.
• Co-culturing of K. pneumoniae with the fungi at different temperatures (26℃ & 37℃) then selecting the fungal species that showed most inhibition of bacterial growth.
• Sub-culturing K. pneumoniae from the less dense zone after co-culture with fungi at 37℃.
• Phenotypic comparison was performed using antibiotic susceptibility testing of K. pneumoniae by disc diffusion method and the results showed that 2 K. pneumoniae isolates with sequence type ST101 tested sensitive to carbapenem antibiotic while the other 3 isolates remained carbapenem resistant.
• Next generation sequencing was done to compare resistance genes and virulence genes of K. pneumoniae before and after co-culture.
• The results of NGS showed loss of resistance genes blaOXA-48 and blaCTX-M-14b were lost from 2 K. pneumoniae isolates with sequence type ST101, while the other 3 K. pneumoniae isolates with sequence type ST383, ST147 didn’t show any change in resistance genes.
• One K. pneumoniae isolate ST383 showed loss in virulence genes fyuA gene and ybtA, ybtE, ybtP, ybtQ, ybtS, ybtT, ybtU, ybtX set of genes that code for different constituents of the bacterial siderophore systems.
• The fungi Scopulariopsis brevicaulis that showed maximum inhibition of the bacterial growth in co-culture was grown on liquid media (peptone sucrose broth) for 3 days then bacterial inoculum of K. pneumoniae MDR 100 μl 0.5 Mcfarland standard was added and incubated for additional 10 days.
• After incubation the media was filtered and centrifuged then the filtrate was partitioned using solvents with different polarities, chloroform and ethyl acetate.
• Concentration of co-culture extract of each solvent using rotary evaporator and the extracts were tested against K. pneumoniae using disc diffusi
• The total extract was tested against K. pneumoniae using disc diffusion method and the ethyl acetate extract showed inhibition of the bacterial growth.
• Chromatographic techniques were performed for ethyl acetate extract to separate compounds that showed antibacterial effect.
• 7 fractions were collected from liquid chromatography and they were tested against
K. pneumoniae using well diffusion method.
• GC-MS was performed for structure elucidation and characterization for the fraction that showed inhibition of K. pneumoniae growth.
• The purified compounds were identified as 11-Octadecenoic acid, 2,4-Di-tert- butylphenol, 2,3-Butanediol and 9-Octadecenamide.

الهدف من هذه الدراسة هو البحث عن مركب له خصائص مضادة للبكتيريا السالبة لصبغة جرام المقاومة للمضادات الحيوية
المتعددة.
ثبت من خلال العديد من الدراسات أن التفاعلات بين البكتيريا والفطريات يمكن أن تحفز إفراز مركبات لم تكن لتفرزفي حالة
نمو الفطر في الظروف العادية، وقد تم تحقيق التفاعل الفطري البكتيري في المختبر باستخدام الزراعة المشتركة و تمت
الدراسة من خلال الخطوات التالية:
 عزل الكلبسيلة الرئوية المقاومة للكاربابينيمات من مرضى وحدة العناية المركزة المصابين بعدوي مجري الدم.
 عزل أنواع فطريات مختلفة من مواقع متعددة مثل التربة وبيئة المستشفى .
 الاستزراع المشترك للفطريات التي تم عزلها مع الكلبسيلة الرئوية عند درجات حرارة مختلفة ) 26 ℃ و 37 )℃
ثم اختيار الأنواع الفطرية التي أظهرت أكثر تثبيط لنمو البكتيريا .
 عزل الكلبسيلة الرئوية بعد فترة الحضانة مع الفطريات
 تم إجراء مقارنة النمط الظاهري للكلبسيلة الرئوية قبل و بعد الالتفاعل الفطري باستخدام اختبار الحساسية
للمضادات الحيوية و تبين ان اثنين من عزلات البكتيريا حدث لهم تغير في مقاوتهم للمضادات الحيوية حيث
اصبحوا حساسين لكربامينيمات بعد ان كانوا مقاومين لهم, بينما الثلاث عزلات البكتيريت الأخري لم يشهدوا نفس
التغيير.
 عمل تسلسل الجيل التالي لمقارنة جينات المقاومة للمضادات الحيوية وجينات عوامل الضراوة للكلبسيلة الرئوية
الرئوية قبل وبعد التفاعل الفطري و تبين ان اثنين من عزلات البكتيريا ST101 خسروا blaOXA-48 و
blaCTX-M-14b و الثلاث عزلات الأخري ST383, ST147 لم يخسروا جينات مسؤولة عن المقاومة
للمضادات الحيوية.
 تم ملاحظة ان عزلة البكتيريا الكلبسيلة الرئوية ST147 خسرت مجموعة من الجينات fyuA و ybtA, ybtE, ybtP, ybtQ, ybtS, ybtT, ybtU, ybtX مسؤولة عن مجموعة مختلفة من انظمة السيدرفور البكتيري.
 تحضير مستخلص التفاعل بين البكتيريا و الفطريات لعزل المركب المضاد للبكتيريا الكلبسيلة الرئوية عن طريق
زراعة الفطر الذي حقق اكبر نسبة تثبيط للنمو البكتيري و هو فطر Scopulariopsis brevicaulis الفطريات
لمدة 3 أيام ثم تمت إضافة اللقاح البكتيري بتركيز 0.5 مكفرلند و استكمال فترة الحضانة لمدة 10 ايام اخري.
 بعد فترة الحضانة يتم ترشيح الميديا بإستخدام ورق ترشيح ثم يضاف المذيب العضوي و الغير عضوي الي
المرشح اولا يضاف الكلوروفورم و يرج جيدا في قمع الفصل ثم يتم تجميع الكلوروفورم و تتم اعادة نفس العملية
بإستخدام الاثيل اسيتات.
 تم اختبار تركيز المستخلص الفطري في كل مذيب باستخدام مبخر دوار وتم اختبار المستخلص ضد الكلبسيلة
الرئوية لمعرفة ايهم له خصائص مضادة للبكتيريا
 ثم يتم عمل فصل للمركب و تنقيته باستخدام الكروماتوجرافيا.
الملخص العربي
45
 تم فصل المستخلص الي 7 اجزاء عن طريق استشراب العمود و تم اختبار السبع اجزاء ضد الكلبسياة الرئوية
لتحديد الجزء صاحب الخصائص المضادة للبكتيريا.
 تم عمل GCMS للجزء صاحب التأثير المضاد للبكتيريا لتحديد المركب او مجموعة المركبات المسؤولة عن هذة
الخصائص و تبين ان هذه المركبات هي
11-Octadecenoic acid, 2,4-Di-tert-butylphenol, 2,3-Butanediol and 9-Octadecenamide

Issued also as CD

Text in English and abstract in Arabic & English.