Thesis (M.Sc.)-Cairo nivsersity,2022.

125-161 :Includes bibliogriphical references.

Abstract Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is currently the most prevalent hepatic disorder and is projected to increase over the next decade. NAFLD is entwined with other metabolic diseases such as obesity, type 2 diabetes mellitus as well as cardiovascular diseases, all of which share a common status of system-wide low-grade inflammation. Resident and recruited macrophages orchestrate this inflammation where both, their distribution and ability to assume a spectrum of distinct phenotypes, imbue them with pivotal roles in the progression of these ailments. Compromised barrier integrity with subsequent bacterial translocation provokes polarization of these macrophages into an aggressive M1 phenotype that drives NAFLD towards the more progressive non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Multiple lines of evidence point out that metabolic rewiring of macrophages lie at the centre of their functional plasticity. As such, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) activation was previously addressed in modulating macrophage polarization (MP) in different tissues. However, the potential role of PPAR activation on ileal MP and whether a likely impact on intestinal integrity and bacterial translocation in a NASH setting exists, remains to be explored. Accordingly, in the present study, an in vitro NASH model was first used to validate the impact of the PPAR α/δ dual activation by elafibranor (ELA) on hepatic fat accumulation. Next, the effect of ELA was investigated in a combined model of dietary NASH and chronic colitis analogous to the clinical presentation of NASH parallel with intestinal barrier dysfunction. The current study findings showed that ileal lamina propria macrophages were skewed towards an M1 phenotype wreaking havoc on the gut barrier. Dual PPAR α/δ activation by ELA restored tight junctional protein expression dampening intestinal inflammation and impeding bacterial translocation in NASH by driving ileal MP towards the M2 phenotype. These changes were aligned with a modulation in hepatic toll-like receptor (TLR)-4/nuclear factor kappa B (NF- κB) along with ileal IL-6/signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signalling pathways. Overall, the present findings suggest that dual PPAR α/δ activation may drive MP in the ileum towards the M2 phenotype improving intestinal integrity towards alleviating NASH experimentally.

يعد إنتشار مرض الكبد الدهني غير الكحولي والتداعيات الحرجة المرتبطة بشكله الأكثر تقدمًا والمعروف بإلتهاب الكبد الدهني غير الكحولي، حاجة ملحة لتوفير علاج فعال. أثبتت الدراسات أن فئة من مرضى إلتهاب الكبد الدهني غير الكحولي تتعرض بشكل خاص للإختلالات في المحور الذي يربط بين أنسجة الكبد والقناة الهضمية. في كثير من الأحيان، تكون العواقب المترتبة عن هذه الإختلالات والتي تظهر على الكبد هي محور اهتمام الكثير من الأبحاث، بينما يتم التغاضي عن التغيرات المرضية التي تصيب الأمعاء والتي تصاحب تدهور هذا المرض. تعتبر العقارات المحفزة لمستقبلات المنشط لتكاثر البيروكسيسوم (PPAR) مرشحة بقوة نظراً لآثارها المتعددة التي تؤثر بشكل إيجابي في كثير من الجوانب الأيضية والإلتهابية لمرض إلتهاب الكبد الدهني غير الكحولي. بينما تم التركيز على تأثير تحفيز تلك المستقبلات في الكبد جيدًا، يظل الدور المحتمل لهذه المستقبلات في الأمعاء، وبالتبعية تدهور الكبد في سياق هذا المرض، غير مستكشف بالكامل.
للإجابة عن تساؤلات هذه الدراسة، ولاستكشاف قدرة عقار الإلافيبرانور في تثبيط تراكم الدهون في الكبد، تم إجراء دراسة معملية على خلايا الكبد (HepG2) خارج الجسم. وقد تم استحداث تراكم الدهون في تلك الخلايا عن طريق تعرضها لخليط من الأحماض الدهنية المحملة على بروتين الألبيومين. تكون هذا الخليط من حمض الأوليك وحمض البالمتيك بنسبة اثنان إلى واحد بحيث يكون التركيز النهائي للخليط والذي تعرضت له الخلايا هو نصف ميكرومولار. تم إضافة عقار الإلافيبرانور في اليوم السابق لتعرض هذه الخلايا لخليط الأحماض الدهنية بتركيز عشرة ميكرومولار. وفي نهاية التجربة، تم صبغ الدهون المتراكمة في الخلايا بمادة Oil Red-O وقياس المساحة التي تم صبغها عن طريق برنامج ImageJ ثم تم قياس مستوى تراكم الدهون الثلاثية.
بالإضافة الى ذلك، أجريت هذه الدراسة للكشف عن الدور المحتمل للتعضيد المزدوج لمستقبلات المنشط لتكاثر البيروكسيسوم من النوع ألفا ودلتا باستخدام عقار الإلافيبرانور (elafibranor-ELA) على المحافظة على سلامة الحاجز المعوي ومنع الإنتقال البكتيري كحدث مرضي مسبب لتدهور إلتهاب الكبد الدهني غير الكحولي. لتحقيق أهداف هذه الدراسة، تم استخدام نموذج من إلتهاب القولون المزمن ونموذج غذائي عالي الدهون معاً، مما يعكس الآثار المترتبة عن اختلال سلامة الحاجز في النسيج المعوي التي تصاحب التغيرات الهستولوجية التي تصيب الكبد في تطور مرض إلتهاب الكبد الدهني غير الكحلي. تم استحداث إلتهاب القولون عن طريق تعاطي دكستران سالفات الصوديوم (DSS) بالإضافة إلى نظام غذائي عالي الدهون لمدة إثنى عشر
أسبوعاً كما ورد في أبحاث سابقة. تلقت الفئران دكستران سالفات الصوديوم بشكل دوري، كل دورة مكونة من سبعة أيام من الدكستران المزود في ماء الشرب ثم عشرة أيام من ماء الشرب الطبيعي.
تم تقسيم الفئران إلى ثلاث مجموعات على النحو الآتي:
المجموعة الأولى (ضابطة طبيعية غير مصابة): هي تلك التي تناولت الغذاء القياسي فقط ومياه شرب طبيعية.
المجموعة الثانية (ضابطة مصابة غير معالجة): هي تلك التي تلقت غذاء عالي الدهن وماء مزود بالدكستران على النحو السالف ذكره.
المجموعة الثالثة (معالجة): هي تلك التي تلقت غذاء عالي الدهن وماء مزود بالدكستران على النحو السالف ذكره بالإضافة الى عقار الإلافيبرانور بداية من الأسبوع التاسع الى الأسبوع الثاني عشر. تم تناول العقار بجرعة ٣٠ مليغرام لكل كيلوغرام عن طريق الفم.
تم إجراء الفحوصات النسيجية في عينات الكبد والأمعاء الغليظة والقولون. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم نفاذية الأمعاء باستخدام اختبار النفاذية (FITC-dextran) وقياس مستوى بروتين ال LBP في الدم. بالإضافة الى ذلك، تم قياس عواقب الإنتقال البكتيري من خلال مراقبة التغيرات الكبدية في التعبير الجيني عن مستقبل شبيه التول من النوع الرابع (TLR4) وقياس البروتينات التي تدل على فاعلية هذا المستقبل مثل المعامل النووي كابا ب ومثبط كابا ب ألفا في صورهم الفسفورية (p-NF-κB / p-IκBα). علاوة على ذلك، تم تقييم سلامة الحاجز المناعي من خلال قياس نسب تصبغ خلايا النسيج المعوي عند استخدام أجسام مضادة لوصلات المحكمة المعوية من نوع كلاودن-١ واوكلودن (claudin-1 / occludin).
نظرًا لحساسية خلايا الماكروفاج المناعية للعوامل التي تؤدي إلى استقطابها في بيئتها المجاورة، فقد تم قياس مستوى إنترفيرون جاما (IFNγ) في عينات النسيج اللفائفي بالإضافة الى قياس نسب التعبير عن TLR4 في النسيج اللفائفي باستخدام الفحوصات المناعية الهيستوكيميائية. تم أيضاً تحديد استقطاب خلايا الماكروفاج من خلال قياس أهم علامات الإستقطاب وهم iNOS وArg1. علاوة على ذلك ولمعرفة الآليات التي أدت إلى استقطاب خلايا الماكروفاج بواسطة عقار الإلافيبرانور، فقد تم قياس مستويات البروتينات المختلفة التي تنتمي لمحور الإشارات الخلوية للإنترليوكن-٦ (IL-6) مثل JAK2 وp-STAT3/t-STAT3 في النسيج اللفائفي.
ومن خلال الدراسة الحالية، لوحظت المشاهدات الآتية:
قام عقار الإلافيبرانور بتثبيط تراكم الدهون في خلايا HepG2 حيث أظهرت الفحوصات المعملية لتلك الخلايا مستويات أقل من تراكم الدهون الثلاثية والمساحات المقاسة التي أتبعت صبغة Oil Red-O. كما كشفت الإختبارات النسيجية عن اختلالات هيستولوجية في العينات الكبدية للمجموعة الضابطة المصابة بحيث أظهرت سمات مرض الإلتهاب الكبدي غير الكحولي المميزة مثل التنكس الدهني، وانتفاخ الخلايا الكبدية بالدهون، والتسلل الإلتهابي المعزز. تزامنت هذه التغيرات مع اختلالات متعددة في عينات الأنسجة المعوية، بما في ذلك تقرحات الغشاء المخاطي، وفقدان الخلايا الكأسية، بالإضافة إلى تسلل الكثير من الخلايا المناعية في الطبقة ما تحت المخاطية. وعلى الجانب الآخر، أظهر علاج الإلافيبرانور قدرة على تحسين تلك التغيرات النسيجية حيث أظهرت عينات الكبد للمجموعة المعالجة بنية نسيجية أقرب إلى الطبيعية (مع عدم وجود علامات على التنكس الدهني) والتي تزامنت مع إلتهابات أقل في أنسجة اللفائف والقولون والتي تميزت بتسلل أقل للخلايا المناعية.
بالنسبة لاختبارات سلامة الحاجز المعوي والنفاذية المعوية والعواقب الكبدية التي تترتب على الإنتقال البكتيري من الأمعاء، فقد أظهرت المجموعة الضابطة مستويات قليلة من claudin-1 بينما زادت مستويات الأوكلودين. على الجانب الآخر، أظهرت عينات الدم للمجموعة الضابطة تركيزات أعلى من FITC-dextran واقترنت هذه الإختلالات مع زيادة في التعبير الجيني لTLR4 في الكبد مع زيادة ملحوظة في مستويات p-NF-κB و p-IκBα. على العكس من ذلك، استعاد علاج الإلافيبرانور تعبير claudin-1، و أعاد مستويات FITC-dextran إلى معدلاته الطبيعية، و قام بتقليل التعبير الكبدي لـ TLR4 مما توازى مع نقصان ملحوظ في p-NF-κB و p-IκBα. بينما لم يلحظ أي تغير في نسب LBP بين المجموعات قيد الدراسة.
كشفت اختبارات ELISAلعينات النسيج اللفائفي للمجموعة الضابطة المصابة عن بيئة ملائمة لاستقطاب خلايا الماكروفاج نحو النمط الظاهري المعزز للإلتهابات (M1) حيث لوحظ ارتفاع IFNγ وTLR4 في عينات هذه المجموعة مما انعكس على مؤشرات النمط الظاهري لهذه الخلايا مصحوباً بارتفاع iNOS وانخفاض مؤشر Arg1. وعلى النقيض، أظهرت عينات النسيج اللفائفي للمجموعة المعالجة بعقار الإلافيبرانور تحيزًا كبيرًا تجاه النمط الظاهري لخلايا الماكروفاج M2 المثبط للإلتهابات. علاوة على ذلك، أظهر علاج الإلافيبرانور تعديلات متعددة في بروتينات سلسلة الإشارات الخلوية للسيتوكين IL-6 حيث أظهرت عينات النسيج اللفائفي انخفاضاً ملحوظاً في مستويات IL-6 وJAK2 وزيادة في نسب p-STAT3/t-STAT3.
إجمالا، أدى التنشيط المزدوج لمستقبلات المنشط لتكاثر البيروكسيسوم من النوع ألفا ودلتا باستخدام عقار الإلافيبرانور إلى المحافظة على الكبد ضد مرض إلتهاب الكبد الدهني غير الكحولي المصحوب بانتقال بكتيري حيث حافظ على التركيب النسيجي الطبيعي لأنسجة الكبد واللفائفي والقولون. كما منع الإنتقال البكتيري عن طريق تعزيز مستوى claudin-1. نتائج هذه الدراسة ترجح أن هذه التأثيرات الإيجابية يمكن إرجاعها جزئياً إلى قدرة العقار على تثبيط الإلتهاب المعوي عن طريق تعزيز النمط الظاهري لخلايا الماكروفاج للنمط الظاهري M2 نتيجة لتعديلات في مستويات IL-6/JAK2/STAT3.

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.