Thesis (M.Sc)-Cairo University, 2025.

Bibliography: pages 55-66.

The contamination of animal cell cultures by microorganisms, particularly
Mycoplasma species, poses significant challenges in biomedical research and
biologics manufacturing. Among the most deceptive and persistent contaminants is
Acholeplasma laidlawii, which not only impacts experimental reliability but also
threatens the safety of vaccines, therapeutics, and cell-based applications.
Extracellular Vesicles (EVs) are nanoscale membrane-bound structures secreted by
Mycoplasma species, they have emerged as critical players in microbial
communication and adaptation, transferring bioactive molecules and resistance
mechanisms. This study focuses on characterization of EVs and determination of
their role in mediating virulence and antibiotic resistance. Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA) poses a significant public health risk because it
causes severe infections and is resistant to many prescribed medications making it
difficult to treat MRSA infections effectively. This work specifically evaluates the
potential of EVs derived from Acholeplasma laidlawii-contaminated cell cultures to
synergize with azithromycin (AZM) in combating (MRSA).
A total of 100 cell cultures were collected and screened to identify
Mycoplasma strains. Acholeplasma laidlawii was identified as the primary
contaminant and further confirmed by microbiological and molecular methods. EVs
produced by Acholeplasma laidlawii were separated and characterized using
Dynamic Light Scattering (DLS), Transmission Electron Microscope (TEM) and
Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy. The synergistic effect of EVs and
azithromycin against MRSA was assessed against MRSA. Acholeplasma laidlawii
contamination was identified in 3 % of tested cell lines using gold-standard agar
culture methods, with molecular and biochemical tests confirming its presence and
characteristics. EVs released by A. laidlawii exhibited a size range 30–140 nm, a
stable negative surface charge (-9.68 ± 0.57 mV), and spherical bi-layered structures.
FTIR analysis confirmed the presence of key functional groups associated with
lipids, proteins, and nucleic acids, highlighting the complex biochemical
composition of these vesicles.
The current study demonstrated the antimicrobial potential of the isolated
EVs, which exhibited bacteriostatic activity against Staphylococcus aureus in a disc
diffusion assay. Additionally, ciprofloxacin accumulation within the EVs was
quantified, suggesting their role as drug carriers. The synergistic antimicrobial
effects of EVs and azithromycin (AZM) against methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA) were evaluated using checkerboard assays, revealing a fractional
inhibitory concentration index (ΣFIC) of 0.265, indicating strong synergy.

تلوث مزارع الخلايا الحيوانية بالكائنات الحية الدقيقة، وخصوصًا أنواع المايكوبلازما، يمثل تحديات كبيرة في مجال البحث الطبي الحيوي وصناعة المستحضرات الحيوية. تعد Acholeplasma laidlawii من أكثر الملوثات خداعًا واستمرارية، حيث تؤثر سلبًا على موثوقية التجارب العلمية وتهدد سلامة اللقاحات والعلاجات والتطبيقات المعتمدة على الخلايا. وتُعد الحويصلات خارج الخلوية (Extracellular Vesicles - EVs) تراكيب نانوية مغلفة بغشاء تُفرزها أنواع المايكوبلازما، وقد برزت كعناصر أساسية في التواصل الميكروبي والتكيف، حيث تنقل الجزيئات النشطة حيويًا وآليات المقاومة. يركز هذا البحث على توصيف الحويصلات خارج الخلوية وتحديد دورها في تعزيز الضراوة ومقاومة المضادات الحيوية.
تشكل المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) خطرًا كبيرًا على الصحة العامة، إذ تسبب عدوى خطيرة وتُظهر مقاومة للعديد من الأدوية الموصوفة، مما يجعل علاجها أمرًا صعبًا. يقيّم هذا البحث بشكل خاص إمكانية الحويصلات خارج الخلوية المستمدة من مزارع الخلايا الملوثة بـ Acholeplasma laidlawii تعزيز تأثير الأزيثرومايسين (AZM) في مكافحة المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA).
تم جمع وفحص 100 مزرعة خلوية لتحديد سلالات المايكوبلازما. وتم تحديد Acholeplasma laidlawii كملوث رئيسي وتم تأكيد وجوده باستخدام الطرق الميكروبيولوجية والجزيئية. كما تم فصل الحويصلات خارج الخلوية التي تنتجها هذه السلالة وتوصيفها باستخدام تقنيات مثل تشتت الضوء الديناميكي (Dynamic Light Scattering - DLS)، والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، وتحليل الطيف تحت الأحمر بتحويل فورييه (FT-IR). وتم تقييم التأثير التآزري للحويصلات خارج الخلوية والأزيثرومايسين ضد المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين.
تم اكتشاف تلوث A. laidlawii في 3% من خطوط الخلايا التي تم اختبارها باستخدام طرق زراعة الأجار القياسية، وتم تأكيد وجوده وخصائصه باستخدام الاختبارات الجزيئية والكيميائية الحيوية. وأظهرت الحويصلات التي أفرزها A. laidlawii نطاقًا حجميًا يتراوح بين 30-140 نانومتر، وشحنة سطحية سالبة مستقرة (-9.68 ± 0.57 ميلي فولت)، وهياكل كروية ثنائية الطبقة. وأكد تحليل FTIR وجود مجموعات وظيفية رئيسية مرتبطة بالدهون والبروتينات والأحماض النووية، مما يبرز التركيب الكيميائي الحيوي المعقد لهذه الحويصلات.
أظهر البحث الحالي الإمكانات المضادة للميكروبات للحويصلات المعزولة، حيث أظهرت نشاطًا مثبطًا لنمو المكورات العنقودية الذهبية في اختبار انتشار الأقراص. وتم تحديد تراكم السيبروفلوكساسين داخل الحويصلات، مما يشير إلى دورها كناقلات للأدوية. وتم تقييم التأثيرات التآزرية المضادة للميكروبات للحويصلات والأزيثرومايسين (AZM) ضد المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين باستخدام اختبارات الشرائط المتشابكة (Checkerboard Assays)، وكشف ذلك عن مؤشر تركيز مثبط جزئي (ΣFIC) يبلغ 0.265، مما يشير إلى تآزر قوي.
يوفر هذا البحث أول دليل على تآزر بين الحويصلات خارج الخلوية البكتيرية والمضاد الحيوي أزيثرومايسين. ويقدم هذا النهج المبتكر طريقة جديدة لمكافحة المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين، بالإضافة إلى تقديم رؤى قيمة حول التفاعلات بين الحويصلات خارج الخلوية والمضادات الحيوية.

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.