Thesis (Ph.D)-Cairo University, 2025.

Bibliography: pages 79-104.

Industrial dyes, aromatic amines, and phenolic compounds are persistent pollutants that are
difficult to remove using conventional methods. Laccases offer a green alternative, but
recombinant expression and scalable applications remain limited. Laccases are blue-colored
enzymes that contain multiple copper atoms and are known for their ability to decolorize dyes and
perform free radical polymerization reactions. Using a recombinant pBAD plasmid containing the
gene for expression of Bli-Lacc, a laccase from Bacillus licheniformis ATCC 9945a, we managed
to successfully express the enzyme using chemo competent TOP10 E. coli cells. Purification of
the enzyme was performed using immobilized metal affinity chromatography (IMAC) utilizing
Ni-resin for His-tag purification. The enzyme demonstrated activity towards laccase substrates
such as 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) and syringaldazine
(SGZ). Kinetic constants showed that the Km for ABTS and SGZ was 1.05 ± 0.16 mM and 0.204
± 0.014 mM while the kcat was 9.04 ± 0.52 min-1 and 12.96 ± 0.3 min-1, respectively. After activity
confirmation, the enzyme was tested for its ability to biotransform a range of substrates including
azodyes (Acid Red 183 and Congo Red), an aromatic amine (aniline), and phenolic compounds
(o-chlorophenol and β-naphthol). Out of the tested substrates, the enzyme showed an ability to
polymerize β-naphthol and the reaction produced a brown solid. Using 1H NMR, 13C NMR and
FTIR, we confirmed the chemical structure of the resulting polymer. Solid-state NMR showed two
types of hydroxyl groups and a very small number of ether bonds (less than 2%). This indicated
that polymerization mainly happened on the aromatic ring carbons, not the ones attached to
hydroxyl groups, forming a compact, multi-ring structure. Stepwise optimization of the
polymerization showed that the best conditions producing maximum polymer yield, as determined
using OD600nm measurement and dry weight, were 37 °C, pH 10, and 1000 nM enzyme
concentration in 50 mM phosphate buffer. A 100 milligram-scale conversion of β-naphthol
produced 40 mg net weight dry polymer showcasing an almost 40% yield. Overall, this study
demonstrates a green, enzyme-based method for converting phenolic compounds into potentially
useful polymers.

تُعد إنزيمات اللاكيز إنزيمات زرقاء اللون تحتوي على عدة ذرات نحاسية، وتُعرف بقدرتها على إزالة لون الأصباغ وإجراء تفاعلات البلمرة عبر الجذور الحرة وفي هذه الدراسة تم التعبير عن إنزيم Bli-Lacc، وهو إنزيم لاكيز مشتق من بكتريا Bacillus licheniformis، باستخدام بلازميد مؤتلف من نوع pBAD يحتوي على الجين المسؤول عن تكوين الانزيم، وذلك في خلايا E. coli TOP10 الكفؤة كيميائيًا. تم تنقية الإنزيم باستخدام كروماتوجرافيا البروتين اعتمادا على سلسلة الهيستيدين المتصلة بجين اللاكيز لتنقية البروتين وأظهر الإنزيم نشاطًا تجاه ركائز اللاكيز مثل ABTS وSGZ، وتم تحديد الثوابت الحركية حيث بلغ ثابت ميخايليس-منتن (Km) لكل من ABTS و SGZ حوالي 1.05 ± 0.16 مليمول و0.204 ± 0.014 مليمول على التوالي، بينما بلغت قيم التحول الحفزي (kcat) حوالي 9.04 ± 0.52 و12.96 ± 0.3 دقيقة⁻¹علىالترتيب.
بعد تأكيد النشاط الإنزيمي، تم اختبار قدرة الإنزيم على تحويل مجموعة من المركبات تشمل أصباغ الآزو (مثل Acid Red 183 وCongo Red، ومركب أليفاتي عطري (الأنيلين)، ومركبات فينولية مثل o- chlorophenol و β-naphthol ومن بين جميع المركبات، أظهر الإنزيم قدرة على بلمرة β-naphthol، وأدى التفاعل إلى تكوين مادة صلبة بنية اللون.
تم تأكيد التركيب الكيميائي للبوليمر الناتج باستخدام تقنيات التحليل الطيفي، بما في ذلك الرنين المغناطيسي النووي للهيدروجين والكربون H1NMR) و C13 NMR) بالإضافة إلى مطيافية الأشعة تحت الحمراء(FTIR).
وقد بيّنت بيانات NMR في الحالة الصلبة وجود نوعين من مجموعات الهيدروكسيل وعدد قليل جدًا من روابط الإيثر (أقل من 2%)، مما يشير إلى أن البلمرة حدثت بشكل رئيسي على ذرات الكربونفي الحلقة العطرية، وليس على الذرات المرتبطة بمجموعات الهيدروكسيل، منتجة بنية مدمجة متعددة الحلقات.
أظهرت عملية تحسين التفاعل أن أفضل ظروف لإنتاج أعلى كمية من البوليمر حسب قياسات OD عند 600 نانومتر والوزن الجاف) كانت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، و الأس الهيدروجيني 10 ، وتركيز إنزيم 1000 نانومول في محلول فوسفات بتركيز 50 مليمول.
ولأغراض التوسع الصناعي، تمت محاولة تحويل كمية 1 غرام من الركيزة، ولكن نظرًا لانخفاض إنتاجية الإنزيم، تم تنفيذ التفاعل باستخدام 100 ملغم من β-naphthol ، ثم تم إسقاط النتائج على مقياس 1 غرام وقد نتج عن تفاعل الـ100 ملغم حوالي 40 ملغم بوليمر جاف، ما يعادل تقريبًا 40% من العائد الكلي.
بشكل عام، تُظهر هذه الدراسة طريقة خضراء قائمة على استخدام الإنزيمات لتحويل المركبات الفينولية إلى بوليمرات قد تكون ذات قيمة تطبيقية ومستدامة.

Issues also as CD.

Text in English and abstract in Arabic & English.