Genetic engineering of probiotic strains as oral vaccine carriers against clostridium difficile infection /
May Mohamed Awad Bahr,
Genetic engineering of probiotic strains as oral vaccine carriers against clostridium difficile infection / " الهندسة الوراثية لسلالات من بكتيريا المدعمات الحيوية (البروبيوتك) لإنتاج لقاح فموى ضد الإصابة بعدوى الكلوستريديم ديفيسيل/ by May Mohamed Awad Bahr ; Supervision Prof. Nahla Mokhtar Mansour, Prof. Marwa Tarek ElRakaib. - 97 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (Ph.D)-Cairo University, 2024.
Bibliography: pages 83-97.
The reduction of toxin A gene copies within the mice fecal samples was evaluated by quantitative PCR and expressed by the increase of Ct value from 20.6 in the untreated mice group and 47.4 in the probiotic-treated mice group to 64.9 in the engineered probiotic-vaccinated mice group. Moreover, the histopathological analysis of mice tissues showed that the structural integrity of the examined intestinal and liver cells was maintained in the engineered probiotic-vaccinated group compared to the probiotic-treated and the untreated groups which confirmed the protection effects of the engineered strains from CDI.
The immunohistochemistry (IHC) findings in the examined mice intestine exhibited a range of mild positive to completely negative immunoreaction against the C. difficile toxin A antigen within the engineered probiotic-vaccinated mice group compared to unvaccinated mice group which showed positive immunoreaction against C. difficile toxin A antigen. Furthermore, the mice serum immunoglobulin analysis confirmed the ability of the engineered strains to increase the levels of different serum’s immunoglobulins (IgG, IgA, and IgM). Finally, the engineered strains showed the ability to increase the survival percentages of mice during the challenge experiment with C. difficile. The engineered probiotic-vaccinated mice group showed survival of 87.5% at the end of the experiment compared to 75% survival of the probiotic-treated group and 37.5% of untreated group. عدوي الكلوستريديم ديفيسيل هي نوع من العدوى المرتبطة بالمضادات الحيوية الموجودة في المستشفيات والمنتشرة في جميع أنحاء العالم. يمكن أن تسبب هذه البكتيريا الممرضة أعراض خطيرة عن طريق إطلاق السموم. إن استراتيجية التطعيم التي تستهدف هذه السموم ستوفر آلية وقائية واعدة ضد الأصابة بالعدوى. تم تصميم هذه الدراسة لإجراء هندسة وراثية لسلالات من البروبيوتيك لتثبيط عدوي الكلوستريديم ديفيسيل. تم تقييم السلالات المعدلة وراثيا لتقديم نهجًا جديدًا أقل تكلفة للتحكم في هذه العدوي لتعزيز السلامة والصحة العامة.
فى هذه الدراسة تم عزل الجزء غير السام من جين tcdB الذي يشفر السم B بواسطة PCR من سلالة الكلوستريديم ديفيسيل وربطه فى بلازميد الأستنساخ pDrive و ادخالها إلى سلالة E. coli EZ. تم استئصال جزء tcdB من ناقل الاستنساخ بواسطة الانزيمات BamHI وXhoI ثم تم استنساخه في بلازميد التعبير pLB210 المحفز عن طريق الأملاح الصفراوية. ونتيجة لذلك، تم بناء ناقل التعبير pLB210-tcdB وإدخاله إلى سلالة E. coli EZ وسلالات البروبيوتك Enterococcus faecium NM1015 وLactobacillus gasseri ATCC 33323.
لتأكيد التعبير عن الجين المستهدف عن طريق سلالات البروبيوتك المعدلة تم إجراء RT-PCR الناجم عن إضافة الأملاح الصفراوية. تناولت الدراسة أيضا إجراء اختبار استقرار البلازميد المحور حيث أثبتت النتائج ثبات البلازميد بنسبة تفوق ۸٥% في كلا السلالتين بعد نموها الي ۲۱۰ جيل تقريبا. بالأضافة الى ذلك, تم تقييم ثبات السلالات المعدلة ضد الظروف القاسية في الجهاز الهضمي مثل تحمل البيئة الحمضية والأملاح الصفراوية وأنزيم البنكرياس حيث أكدت النتائج قدرة السلالات المحورة على الاحتفاظ بخصائص البروبيوتك.
و كذلك تناولت الدراسة أختبار مستوى فاعلية و أمان تلك السلالات المهندسة وراثيا فى فئران التجارب حيث أكدت النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل عينات براز الفئران قدرة السلالات المحورة على تقليل عدد البكتيريا الممرضة ونسخ الجينات السامة. بالإضافة إلى ذلك، أظهر فحض أنسجة الفئران الحفاظ على سلامة خلايا الكبد و الأمعاء. كما أظهرت نتائج الكيمياء المناعية في أنسجة أمعاء الفئران التي تم فحصها مجموعة من التفاعل المناعي الإيجابي البسيط إلى السلبي تمامًا داخل مجموعة الفئران المعطاة بكتيريا البروبيوتك المعدلة. علاوة على ذلك، أكد تحليل الفحص المناعي لعينات الدم قدرة السلالات المحورة على تحفيز المناعة. كما أظهرت السلالات المُعدلة جينيا القدرة على زيادة نسب بقاء الفئران على قيد الحياة بنسبة ٥, ۸٧% مقارنة بمجموعة الفئران الغير محصنة بالسلالات المعدلة حيث أظهرت النتائج بقاء ٥, ۳٧% فقط على قيد الحياة.
Text in English and abstract in Arabic & English.
Medical Microbiology
Lactobacillus gasseri Enterococcus faecium anaerobic infection recombinant vectors cloning tcdB bacterial transformation bile inducible plasmid
616.01
Genetic engineering of probiotic strains as oral vaccine carriers against clostridium difficile infection / " الهندسة الوراثية لسلالات من بكتيريا المدعمات الحيوية (البروبيوتك) لإنتاج لقاح فموى ضد الإصابة بعدوى الكلوستريديم ديفيسيل/ by May Mohamed Awad Bahr ; Supervision Prof. Nahla Mokhtar Mansour, Prof. Marwa Tarek ElRakaib. - 97 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (Ph.D)-Cairo University, 2024.
Bibliography: pages 83-97.
The reduction of toxin A gene copies within the mice fecal samples was evaluated by quantitative PCR and expressed by the increase of Ct value from 20.6 in the untreated mice group and 47.4 in the probiotic-treated mice group to 64.9 in the engineered probiotic-vaccinated mice group. Moreover, the histopathological analysis of mice tissues showed that the structural integrity of the examined intestinal and liver cells was maintained in the engineered probiotic-vaccinated group compared to the probiotic-treated and the untreated groups which confirmed the protection effects of the engineered strains from CDI.
The immunohistochemistry (IHC) findings in the examined mice intestine exhibited a range of mild positive to completely negative immunoreaction against the C. difficile toxin A antigen within the engineered probiotic-vaccinated mice group compared to unvaccinated mice group which showed positive immunoreaction against C. difficile toxin A antigen. Furthermore, the mice serum immunoglobulin analysis confirmed the ability of the engineered strains to increase the levels of different serum’s immunoglobulins (IgG, IgA, and IgM). Finally, the engineered strains showed the ability to increase the survival percentages of mice during the challenge experiment with C. difficile. The engineered probiotic-vaccinated mice group showed survival of 87.5% at the end of the experiment compared to 75% survival of the probiotic-treated group and 37.5% of untreated group. عدوي الكلوستريديم ديفيسيل هي نوع من العدوى المرتبطة بالمضادات الحيوية الموجودة في المستشفيات والمنتشرة في جميع أنحاء العالم. يمكن أن تسبب هذه البكتيريا الممرضة أعراض خطيرة عن طريق إطلاق السموم. إن استراتيجية التطعيم التي تستهدف هذه السموم ستوفر آلية وقائية واعدة ضد الأصابة بالعدوى. تم تصميم هذه الدراسة لإجراء هندسة وراثية لسلالات من البروبيوتيك لتثبيط عدوي الكلوستريديم ديفيسيل. تم تقييم السلالات المعدلة وراثيا لتقديم نهجًا جديدًا أقل تكلفة للتحكم في هذه العدوي لتعزيز السلامة والصحة العامة.
فى هذه الدراسة تم عزل الجزء غير السام من جين tcdB الذي يشفر السم B بواسطة PCR من سلالة الكلوستريديم ديفيسيل وربطه فى بلازميد الأستنساخ pDrive و ادخالها إلى سلالة E. coli EZ. تم استئصال جزء tcdB من ناقل الاستنساخ بواسطة الانزيمات BamHI وXhoI ثم تم استنساخه في بلازميد التعبير pLB210 المحفز عن طريق الأملاح الصفراوية. ونتيجة لذلك، تم بناء ناقل التعبير pLB210-tcdB وإدخاله إلى سلالة E. coli EZ وسلالات البروبيوتك Enterococcus faecium NM1015 وLactobacillus gasseri ATCC 33323.
لتأكيد التعبير عن الجين المستهدف عن طريق سلالات البروبيوتك المعدلة تم إجراء RT-PCR الناجم عن إضافة الأملاح الصفراوية. تناولت الدراسة أيضا إجراء اختبار استقرار البلازميد المحور حيث أثبتت النتائج ثبات البلازميد بنسبة تفوق ۸٥% في كلا السلالتين بعد نموها الي ۲۱۰ جيل تقريبا. بالأضافة الى ذلك, تم تقييم ثبات السلالات المعدلة ضد الظروف القاسية في الجهاز الهضمي مثل تحمل البيئة الحمضية والأملاح الصفراوية وأنزيم البنكرياس حيث أكدت النتائج قدرة السلالات المحورة على الاحتفاظ بخصائص البروبيوتك.
و كذلك تناولت الدراسة أختبار مستوى فاعلية و أمان تلك السلالات المهندسة وراثيا فى فئران التجارب حيث أكدت النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل عينات براز الفئران قدرة السلالات المحورة على تقليل عدد البكتيريا الممرضة ونسخ الجينات السامة. بالإضافة إلى ذلك، أظهر فحض أنسجة الفئران الحفاظ على سلامة خلايا الكبد و الأمعاء. كما أظهرت نتائج الكيمياء المناعية في أنسجة أمعاء الفئران التي تم فحصها مجموعة من التفاعل المناعي الإيجابي البسيط إلى السلبي تمامًا داخل مجموعة الفئران المعطاة بكتيريا البروبيوتك المعدلة. علاوة على ذلك، أكد تحليل الفحص المناعي لعينات الدم قدرة السلالات المحورة على تحفيز المناعة. كما أظهرت السلالات المُعدلة جينيا القدرة على زيادة نسب بقاء الفئران على قيد الحياة بنسبة ٥, ۸٧% مقارنة بمجموعة الفئران الغير محصنة بالسلالات المعدلة حيث أظهرت النتائج بقاء ٥, ۳٧% فقط على قيد الحياة.
Text in English and abstract in Arabic & English.
Medical Microbiology
Lactobacillus gasseri Enterococcus faecium anaerobic infection recombinant vectors cloning tcdB bacterial transformation bile inducible plasmid
616.01