In-vitro evaluation of hemostatic efficacy, anti-microbial activity, and cytotoxicity of aerogel derivatized-chitosan /
Khalid Wael Abdullatif Mohamed,
In-vitro evaluation of hemostatic efficacy, anti-microbial activity, and cytotoxicity of aerogel derivatized-chitosan / التقييم المعملي لكفاءة الإرقاء، والنشاط مضاد الميكروبات، ومستوي السمية للهلام الهوائي من مشتقات الكيتوزان by Khalid Wael Abdullatif Mohamed ; Supervised Prof. Dr. Emad El-Zayat, Prof. Maher Z. El-Sabaa, Prof. Dr. Mehrez El-Naggar. - 83 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (M.Sc)-Cairo University, 2025
Bibliography: pages 82-83.
This thesis reports the design, fabrication, and evaluation of chitosan microflowers
(CMF) embedded in gelatin (GE) sponges as multifunctional wound dressings that combine
rapid hemostasis with broad-spectrum antimicrobial performance. CMF were produced through
a modified one-pot route: ionotropic gelation of chitosan with tripolyphosphate (TPP) to form
Cs–TPP nanocomplexes, followed by CaCl₂-driven anisotropic growth of calcium pyrophosphate
on the chitosan surface to yield “micro-flower” architectures. Systematic optimization
established 150 mM CaCl₂ and 125 g/L TPP as the optimum concentrations for well-defined
flowers; deviating from this window generated irregular, non-flower morphologies. The
formation mechanism involves TPP hydrolysis to P₂O₇⁴⁻ and subsequent growth of Ca₂P₂O₇
platelets on chitosan, building the hierarchical petals.
CMF were incorporated into gelatin to obtain CMF0@GE (GE only), CMF1@GE, and
CMF2@GE sponges. GE solutions were prepared at 50 °C (water bath; room-temperature
preparation was not feasible) and cross-linked with 0.03% glutaraldehyde before lyophilization.
SEM showed porous interconnected networks with CMF petals distributed through the matrix;
EDS confirmed C, O, Na, P, and Ca (P ≈ 15.8%, Ca ≈ 9.5%); XRD verified calcium phosphate
(Ca₃(PO₄)₂) phases. Density decreased and PBS uptake and BET surface area increased with CMF
loading. TGA revealed ~15% mass loss at 50–200 °C (bound/free water) and major degradation
between 200–450 °C (~60% for CMF2@GE; ~55% for CMF0@GE).
Biocompatibility assessed by the SRB assay on human skin fibroblasts (HSF)
showed >90% viability below 100 µg/mL CMF. Antibacterial performance was evaluated against
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, and Enterococcus
faecium. Disc/agar diffusion demonstrated dose-dependent zones of inhibition with CMF2 and
CMF2@GE giving the largest ZOIs. MIC (resazurin) for CMF-2 ranged approximately 25–
100 µg/mL depending on the strain. Time-kill assays showed up to ~6-log CFU reductions within
60–120 min (fastest for P. aeruginosa and K. pneumoniae). Growth-curve kinetics and
protein-leakage (Bradford) confirmed membrane disruption, highest with CMF-2. Biofilm assays
(1, 3, 5 days) on cryogels demonstrated significant inhibition of adhesion and biomass,
maximized in CMF2@GE.
Hemostatic function measured by an in-vitro whole-blood clotting test showed that all
CMF@GE sponges shortened clotting times versus the control; CMF2@GE achieved the shortest
average time (~170–213 s), indicating rapid coagulation support.
In summary, CMF@GE sponges combine biocompatibility, antibacterial activity, and
accelerated hemostasis. Their scalable preparation (with clearly defined optimal chemistries:
TPP 125 g/L, CaCl₂ 150 mM, glutaraldehyde 0.03%, GE at 50 °C) and robust performance
position them as promising candidates for clinical wound care and infection control. تتناول هذه الأطروحة تصميم وتصنيع وتقييم زهور الكيتوزان الدقيقة (CMF) المدمجة في إسفنجات الجيلاتين (GE) كضمادات جروح متعددة الوظائف تجمع بين
الوقف السريع للنزيف والأداء المضاد للميكروبات واسع النطاق. تم إنتاج زهور الكيتوزان الدقيقة (CMF) من خلال مسار معدل أحادي الخطوة: التجليد الأيوني للكيتوزان مع ثلاثي فوسفات الكالسيوم (TPP) لتكوين
مركبات نانوية من Cs–TPP، متبوعًا بنمو غير متناحٍ لفوسفات الكالسيوم على سطح الكيتوزان مدفوعًا بكلوريد الكالسيوم (CaCl₂) لإنتاج هياكل "زهور دقيقة". وقد أثبت التحسين المنهجي
أن 150 ملي مولار من كلوريد الكالسيوم (CaCl₂) و125 غ/لتر من ثلاثي فوسفات الكالسيوم (TPP) هما التركيزان الأمثلان للحصول على زهور محددة جيدًا؛ إذ أن الانحراف عن هذا النطاق أدى إلى ظهور أشكال غير منتظمة وغير زهرية. تتضمن آلية التكوين تحلل ثلاثي فوسفات الصوديوم (TPP) إلى P₂O₇⁴⁻، ثم نمو صفائح Ca₂P₂O₇ على الكيتوزان، مما يؤدي إلى تكوين بتلات هرمية.
تم دمج ألياف السليلوز الدقيقة (CMF) في الجيلاتين للحصول على إسفنجات CMF0@GE (الجيلاتين فقط)، وCMF1@GE، وCMF2@GE. تم تحضير محاليل الجيلاتين عند 50 درجة مئوية (في حمام مائي؛ حيث لم يكن التحضير في درجة حرارة الغرفة ممكنًا) وربطها عرضيًا باستخدام 0.03% من الغلوتارالدهيد قبل التجفيف بالتجميد.
أظهرت صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) شبكات مسامية مترابطة مع بتلات ألياف السليلوز الدقيقة موزعة في جميع أنحاء المادة الأساسية؛ وأكد تحليل طيف الأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDS) وجود الكربون والأكسجين والصوديوم والفوسفور والكالسيوم (P ≈ 15.8%، Ca ≈ 9.5%)؛ وأكد تحليل حيود الأشعة السينية (XRD) وجود طور فوسفات الكالسيوم
(Ca₃(PO₄)₂). انخفضت الكثافة، وزاد امتصاص محلول الفوسفات الملحي (PBS) ومساحة سطح BET مع زيادة تحميل ألياف السليلوز الدقيقة. أظهر تحليل الوزن الحراري (TGA) فقدانًا في الكتلة بنسبة 15% تقريبًا عند درجة حرارة 50-200 درجة مئوية (الماء المرتبط/الماء الحر) وتحللًا كبيرًا
بين 200-450 درجة مئوية (60% تقريبًا لـ CMF2@GE؛ 55% تقريبًا لـ CMF0@GE).
أظهرت دراسة التوافق الحيوي، التي أجريت باستخدام اختبار SRB على خلايا ليفية جلدية بشرية (HSF)، حيويةً تزيد عن 90% عند تركيز أقل من 100 ميكروغرام/مل من CMF. تم تقييم الأداء المضاد للبكتيريا ضد
الزائفة الزنجارية، والكلبسيلة الرئوية، والمكورات العنقودية الذهبية، والمكورات المعوية البرازية.
أظهر اختبار انتشار القرص/الأجار مناطق تثبيط تعتمد على الجرعة، حيث أعطى كل من CMF2 وCMF2@GE أكبر مناطق التثبيط. تراوح الحد الأدنى للتركيز المثبط (الريزازورين) لـ CMF-2 بين 25 و100 ميكروغرام/مل تقريبًا، وذلك حسب السلالة. أظهرت اختبارات القتل الزمني انخفاضًا في عدد المستعمرات البكتيرية يصل إلى 6 لوغاريتمات خلال 60-120 دقيقة (الأسرع بالنسبة لبكتيريا الزائفة الزنجارية وبكتيريا الكلبسيلة الرئوية). وأكدت حركية منحنى النمو وتسرب البروتين (برادفورد) تمزق الغشاء، وكان أعلى مستوى له مع CMF-2. وأظهرت اختبارات الأغشية الحيوية (1، 3، 5 أيام) على الهلاميات المبردة تثبيطًا كبيرًا للالتصاق والكتلة الحيوية، وكان أقصى ما يمكن في CMF2@GE. وأظهرت وظيفة الإرقاء المقاسة بواسطة اختبار تخثر الدم الكامل في المختبر أن جميع إسفنجات CMF@GE قللت من أوقات التخثر مقارنةً بالمجموعة الضابطة؛ وحققت CMF2@GE أقصر متوسط وقت (170-213 ثانية تقريبًا)، مما يشير إلى دعم سريع للتخثر.
باختصار، تجمع إسفنجات CMF@GE بين التوافق الحيوي والنشاط المضاد للبكتيريا والإرقاء المتسارع. إن إمكانية تحضيرها على نطاق واسع (مع تركيبات كيميائية مثالية محددة بوضوح:
TPP 125 جم/لتر، CaCl₂ 150 ملي مولار، غلوتارالدهيد 0.03%، GE عند 50 درجة مئوية) وأدائها القوي يجعلها مرشحة واعدة للعناية السريرية بالجروح ومكافحة العدوى.
Text in English and abstract in Arabic & English.
Biotechnology
التقنية الحيوية
Hemostatic Anti-microbial Cytotoxicity Aerogel Derivatized
660.6
In-vitro evaluation of hemostatic efficacy, anti-microbial activity, and cytotoxicity of aerogel derivatized-chitosan / التقييم المعملي لكفاءة الإرقاء، والنشاط مضاد الميكروبات، ومستوي السمية للهلام الهوائي من مشتقات الكيتوزان by Khalid Wael Abdullatif Mohamed ; Supervised Prof. Dr. Emad El-Zayat, Prof. Maher Z. El-Sabaa, Prof. Dr. Mehrez El-Naggar. - 83 pages : illustrations ; 25 cm. + CD.
Thesis (M.Sc)-Cairo University, 2025
Bibliography: pages 82-83.
This thesis reports the design, fabrication, and evaluation of chitosan microflowers
(CMF) embedded in gelatin (GE) sponges as multifunctional wound dressings that combine
rapid hemostasis with broad-spectrum antimicrobial performance. CMF were produced through
a modified one-pot route: ionotropic gelation of chitosan with tripolyphosphate (TPP) to form
Cs–TPP nanocomplexes, followed by CaCl₂-driven anisotropic growth of calcium pyrophosphate
on the chitosan surface to yield “micro-flower” architectures. Systematic optimization
established 150 mM CaCl₂ and 125 g/L TPP as the optimum concentrations for well-defined
flowers; deviating from this window generated irregular, non-flower morphologies. The
formation mechanism involves TPP hydrolysis to P₂O₇⁴⁻ and subsequent growth of Ca₂P₂O₇
platelets on chitosan, building the hierarchical petals.
CMF were incorporated into gelatin to obtain CMF0@GE (GE only), CMF1@GE, and
CMF2@GE sponges. GE solutions were prepared at 50 °C (water bath; room-temperature
preparation was not feasible) and cross-linked with 0.03% glutaraldehyde before lyophilization.
SEM showed porous interconnected networks with CMF petals distributed through the matrix;
EDS confirmed C, O, Na, P, and Ca (P ≈ 15.8%, Ca ≈ 9.5%); XRD verified calcium phosphate
(Ca₃(PO₄)₂) phases. Density decreased and PBS uptake and BET surface area increased with CMF
loading. TGA revealed ~15% mass loss at 50–200 °C (bound/free water) and major degradation
between 200–450 °C (~60% for CMF2@GE; ~55% for CMF0@GE).
Biocompatibility assessed by the SRB assay on human skin fibroblasts (HSF)
showed >90% viability below 100 µg/mL CMF. Antibacterial performance was evaluated against
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, and Enterococcus
faecium. Disc/agar diffusion demonstrated dose-dependent zones of inhibition with CMF2 and
CMF2@GE giving the largest ZOIs. MIC (resazurin) for CMF-2 ranged approximately 25–
100 µg/mL depending on the strain. Time-kill assays showed up to ~6-log CFU reductions within
60–120 min (fastest for P. aeruginosa and K. pneumoniae). Growth-curve kinetics and
protein-leakage (Bradford) confirmed membrane disruption, highest with CMF-2. Biofilm assays
(1, 3, 5 days) on cryogels demonstrated significant inhibition of adhesion and biomass,
maximized in CMF2@GE.
Hemostatic function measured by an in-vitro whole-blood clotting test showed that all
CMF@GE sponges shortened clotting times versus the control; CMF2@GE achieved the shortest
average time (~170–213 s), indicating rapid coagulation support.
In summary, CMF@GE sponges combine biocompatibility, antibacterial activity, and
accelerated hemostasis. Their scalable preparation (with clearly defined optimal chemistries:
TPP 125 g/L, CaCl₂ 150 mM, glutaraldehyde 0.03%, GE at 50 °C) and robust performance
position them as promising candidates for clinical wound care and infection control. تتناول هذه الأطروحة تصميم وتصنيع وتقييم زهور الكيتوزان الدقيقة (CMF) المدمجة في إسفنجات الجيلاتين (GE) كضمادات جروح متعددة الوظائف تجمع بين
الوقف السريع للنزيف والأداء المضاد للميكروبات واسع النطاق. تم إنتاج زهور الكيتوزان الدقيقة (CMF) من خلال مسار معدل أحادي الخطوة: التجليد الأيوني للكيتوزان مع ثلاثي فوسفات الكالسيوم (TPP) لتكوين
مركبات نانوية من Cs–TPP، متبوعًا بنمو غير متناحٍ لفوسفات الكالسيوم على سطح الكيتوزان مدفوعًا بكلوريد الكالسيوم (CaCl₂) لإنتاج هياكل "زهور دقيقة". وقد أثبت التحسين المنهجي
أن 150 ملي مولار من كلوريد الكالسيوم (CaCl₂) و125 غ/لتر من ثلاثي فوسفات الكالسيوم (TPP) هما التركيزان الأمثلان للحصول على زهور محددة جيدًا؛ إذ أن الانحراف عن هذا النطاق أدى إلى ظهور أشكال غير منتظمة وغير زهرية. تتضمن آلية التكوين تحلل ثلاثي فوسفات الصوديوم (TPP) إلى P₂O₇⁴⁻، ثم نمو صفائح Ca₂P₂O₇ على الكيتوزان، مما يؤدي إلى تكوين بتلات هرمية.
تم دمج ألياف السليلوز الدقيقة (CMF) في الجيلاتين للحصول على إسفنجات CMF0@GE (الجيلاتين فقط)، وCMF1@GE، وCMF2@GE. تم تحضير محاليل الجيلاتين عند 50 درجة مئوية (في حمام مائي؛ حيث لم يكن التحضير في درجة حرارة الغرفة ممكنًا) وربطها عرضيًا باستخدام 0.03% من الغلوتارالدهيد قبل التجفيف بالتجميد.
أظهرت صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) شبكات مسامية مترابطة مع بتلات ألياف السليلوز الدقيقة موزعة في جميع أنحاء المادة الأساسية؛ وأكد تحليل طيف الأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDS) وجود الكربون والأكسجين والصوديوم والفوسفور والكالسيوم (P ≈ 15.8%، Ca ≈ 9.5%)؛ وأكد تحليل حيود الأشعة السينية (XRD) وجود طور فوسفات الكالسيوم
(Ca₃(PO₄)₂). انخفضت الكثافة، وزاد امتصاص محلول الفوسفات الملحي (PBS) ومساحة سطح BET مع زيادة تحميل ألياف السليلوز الدقيقة. أظهر تحليل الوزن الحراري (TGA) فقدانًا في الكتلة بنسبة 15% تقريبًا عند درجة حرارة 50-200 درجة مئوية (الماء المرتبط/الماء الحر) وتحللًا كبيرًا
بين 200-450 درجة مئوية (60% تقريبًا لـ CMF2@GE؛ 55% تقريبًا لـ CMF0@GE).
أظهرت دراسة التوافق الحيوي، التي أجريت باستخدام اختبار SRB على خلايا ليفية جلدية بشرية (HSF)، حيويةً تزيد عن 90% عند تركيز أقل من 100 ميكروغرام/مل من CMF. تم تقييم الأداء المضاد للبكتيريا ضد
الزائفة الزنجارية، والكلبسيلة الرئوية، والمكورات العنقودية الذهبية، والمكورات المعوية البرازية.
أظهر اختبار انتشار القرص/الأجار مناطق تثبيط تعتمد على الجرعة، حيث أعطى كل من CMF2 وCMF2@GE أكبر مناطق التثبيط. تراوح الحد الأدنى للتركيز المثبط (الريزازورين) لـ CMF-2 بين 25 و100 ميكروغرام/مل تقريبًا، وذلك حسب السلالة. أظهرت اختبارات القتل الزمني انخفاضًا في عدد المستعمرات البكتيرية يصل إلى 6 لوغاريتمات خلال 60-120 دقيقة (الأسرع بالنسبة لبكتيريا الزائفة الزنجارية وبكتيريا الكلبسيلة الرئوية). وأكدت حركية منحنى النمو وتسرب البروتين (برادفورد) تمزق الغشاء، وكان أعلى مستوى له مع CMF-2. وأظهرت اختبارات الأغشية الحيوية (1، 3، 5 أيام) على الهلاميات المبردة تثبيطًا كبيرًا للالتصاق والكتلة الحيوية، وكان أقصى ما يمكن في CMF2@GE. وأظهرت وظيفة الإرقاء المقاسة بواسطة اختبار تخثر الدم الكامل في المختبر أن جميع إسفنجات CMF@GE قللت من أوقات التخثر مقارنةً بالمجموعة الضابطة؛ وحققت CMF2@GE أقصر متوسط وقت (170-213 ثانية تقريبًا)، مما يشير إلى دعم سريع للتخثر.
باختصار، تجمع إسفنجات CMF@GE بين التوافق الحيوي والنشاط المضاد للبكتيريا والإرقاء المتسارع. إن إمكانية تحضيرها على نطاق واسع (مع تركيبات كيميائية مثالية محددة بوضوح:
TPP 125 جم/لتر، CaCl₂ 150 ملي مولار، غلوتارالدهيد 0.03%، GE عند 50 درجة مئوية) وأدائها القوي يجعلها مرشحة واعدة للعناية السريرية بالجروح ومكافحة العدوى.
Text in English and abstract in Arabic & English.
Biotechnology
التقنية الحيوية
Hemostatic Anti-microbial Cytotoxicity Aerogel Derivatized
660.6